实验2 蛋白质的性质实验6.pptVIP

实验2.蛋白质性质实验 一.蛋白质等电点的测定 二.蛋白质的沉淀及变性 一、蛋白质等电点的测定 实验目的 了解蛋白质的两性解离性质 学习测定蛋白质等电点的一种方法 预期得到的结果及达到的训练效果 学会观察化学反应现象并解释现象 学会正确使用移液管 学习使用涡旋混合器 进一步学习实验报告书写的规范和原则：忠于实验本身而不是忠于课本；正确、精确使用科学的描述语言；加强深入、透彻地分析讨论结果 实验原理 不带电形式 H2N—Cα—H COOH R +H3N—Cα—H COO- R 两性离子形式 调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—+NH3基和—COO-基的解离程度完全相等时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。 H3N—CH—COOH R + 在酸性溶液中的氨基酸 （pH＜pI） H3N—CH—COO- R + 在晶体状态或水溶液中的氨基酸（pH=pI） H2N—CH—COO- R 在碱性溶液中的氨基酸 （pH＞pI） 当氨基酸相互连接成蛋白质时，只有其侧链基团和末端的α-氨基，α-羧基是可以离子化的。 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡 COOH P NH2 COO COO COOH P P P NH2 NH3 NH3 蛋白质分子 - + + - +H+ +H+ +OH- +OH- 阴离子 兼性离子 阳离子 pHpI pH=pI pHpI 电场中：移向阳极 不移动 移向阴极 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度的影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点PI。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。本实验借观察在不同pH值溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。 二、蛋白质沉淀及变性 （一）实验目的： 1.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 2.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义 3.了解蛋白质变性和沉淀的关系 （二）实验原理 在水溶液中的蛋白质分子由于生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 （二）实验原理： （三）蛋白质的沉淀类型： 1.可逆沉淀：此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。 2.不可逆沉淀：此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），蛋白质并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 几种沉淀蛋白质的方法 蛋白质的盐析 重金属离子沉淀蛋白质 有机酸沉淀蛋白质 有机溶剂沉淀蛋白质 变性蛋白质的溶解性 酪蛋白等电点测定 试管号 蒸馏水（mL） 0.01 mol/L蜡酸（mL） 0. 1 mol/L蜡酸(mL) 1. 0 mol/L蜡酸(mL) 1 4.2 0.3 - — 2 4.35 - 0.15 — 3 4.0 - 0.5 — 4 3.7 - - 0.8 乙醇引起的变性与沉淀 试剂 （mL） 管号 5%卵清蛋白质 溶液 0.1mol/L氢氧化钠溶液 0.1mol/L盐酸溶液 95%乙醇 PH4.7缓冲溶液 1 0.5 — — 0.5 0.5 2 0.5 0.5 — 0.5 — 3 0.5 — 0.5 0.5 — 振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻向各管内加入水4