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现代生物学导论生化实验报告 ELISA 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 一、实验目的 　　通过对ELISA实验过程与原理的初步理解，掌握一些生化实验的基本操作，并对抗原抗体的概念有更深的认识。 二、实验原理 　　ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA） 。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 　　此次实验采用间接法，利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检，是检测抗体最常用的方法。 这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 图1 ELISA （间接法）步骤示意图 (示图来源: Principles and Techniques of Practical Biochemistry by Keith Wilson John Walker) 三、仪器与材料 1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 96孔)。 2. 酶联免疫检测仪 　　　　　　　　　　　　　 图2酶联免疫检测仪 3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。 4. 包被液： 0.05 mol/L 碳酸缓冲液（pH 9.6）： Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克， 蒸馏水稀释至100 毫升。 5. 稀释液（PBS-Tween）： NaCl 8克, KCl 0.2克， KH2PO4 0.2克, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween-20，0.5毫升， 蒸馏水加至1000毫升。 6. 洗涤液：同稀释液。 7. 封闭液：0.5 % （质量分数）BSA（用PBS配制）。 8. 邻苯二胺溶液(底物)： 0.1 mol/L 柠檬酸 (2.1克/100毫升), 取6.1毫升， 0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O (7.163克/100毫升),　取6.4毫升, 加蒸馏水12.5毫升, 取邻苯二胺8毫克（溶解）； 临用前加30 % （体积分数）H2O2 40 微升。 9. 终止液：2 mol/L H2SO4。 四、实验步骤 1.包被抗原：将已包被好的抗原注入到平板中，每孔200微升，注入范围平板2号至10号、B至D这一长方形区域，共计27孔，37℃温育半小时 2.到时间后取出，倒尽孔中液体，用PBS-T反复洗涤三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽 3.用0.5﹪的BSA封闭，每孔200微升，温育半小时 4.洗涤同2 5.加一抗：将被检一抗做几种稀释，每孔200微升，加入范围2至9、11列，B至D行，10列加稀释液做对照，37 ℃温育一小时 6. 洗涤同2 7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 37 ℃温育半小时 8. 洗涤同2 9. 加底物：邻苯二胺溶液加200微升，室温暗处5分钟 10. 加终止液：每孔50微升 11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录OD490nm读数 五、实验数据统计 组数 Dilution of the first antibody A490 Sample 1 Sample 2 Sample 3 平均 (No red item) 1 1/400 0.784 0.905 0.677 0.731 2 1/800 0.631 0.506 0.603 0.580 3 1/1600 0.635 0.494 0.584 0.571 4 1/3200 0.324 0.345 0.348 0.339 5 1/6400 0.162 0.205 0.234 0.200 6 1/12800 0.177 0.179 0.166 0.174 7 1/25600 0.096 0.089 0.100 0.095 8 1/51200 0.057 0.042 0.062 0.054 9 No 1st Ab 0.021 0.014 0.030 0.022 10 No Antigen 0.00