液相芯片技术在国内发展现状.docVIP

液相芯片技术在国内发展现状 　　从20世纪90年代开始生物芯片已在全球进行应用，其最初用于基因序列分析、基因表达谱和基因突变体的检测等，主要用于基因分析，故又称为基因芯片或DNA芯片。而随着其被广泛应用于免疫反应、受体结合等领域，出现了蛋白芯片、细胞芯片和组织芯片等[1-2]各种生物芯片。 　　液相芯片是在20世纪90代中期发展起来的，又被称为xMAP技术，集流式细胞技术、激光、数字信号处理系统和传统化学技术为一体的，具有新型通量大、灵活性好，灵敏度高、动力学范围广等优点[3-4]。 　　1原理 　　1.1 Luminex液相芯片的技术原理 Luminex液相芯片技术是基于多种标记有不同荧光染料的聚苯乙烯微球，微球直径一般为5.6 um，微球主要有4种：MicroPlex微球，SeroMap微球、xTAG微球和MagPlex微球。（4种微球原理基本相同，而SeroMap微球是专门为血清学设计的，它可以减少血清中不同抗体与微球的非特异性结合。在临床诊断中主要应用Luminex液相芯片技术用于检测肿瘤指标、细胞因子及其它一些蛋白质物质，因此主要是应用SeroMap微球进行检测。）在液相系统中，为了区分不同的探针，每一种固定有探针的微球都有一个独特的色彩编号，或称荧光编码。不同的颜色微球在激光作用下发出的荧光均不相同，利用这些微球可以分别标记上不同的探针分子。检测时先后加样品和报告分子与标记微球反应，样品中的目的分子（待检测的抗原或抗体）能够与探针和报告分子特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，随后仪器对微球进行检测和结果分析。Luminex检测系统采用微流技术使微球快速单列通过检测通道，并使用红色和绿色两种激光分别对单个微球上的分类荧光和报告分子上的报告荧光进行检测。红色激光可将微球分类，从而鉴定各个不同的反应类型（即定性）；绿色激光可确定微球上结合的报告分子的数量，从而确定微球结合的目的分子的数量（定量）。 　　1.2液相芯片的技术优势 　　1.2.1高通量、高速度、操作方便 分析荧光速度最高可达5000～15000个/s；可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行实时、定性、定量分析，时间不到3 h。其孵育时间比传统的固相检测明显缩短，而ELISA每孔仅只能对一种指标进行检测，虽有自动酶仪，一次也最多只能检测几块板。采用液相芯片法可以提高检测速度。同时针对Luminex系统，国内厂家已生产了配套的自动加样仪系统，基本上已实现全自动化检测。 　　1.2.2高灵敏度 液相芯片的微球表面积大于固相表面，固定的包被抗体可达100000个。提高了检测的灵敏度，检测范围或达3～5个数量级，最低检测浓度可达0.1 pg/mL。 　　1.2.3特异性强、准确性好 因为是采用均相免疫检测，与异相免疫相比实验无需进行洗涤，减少了在操作过程中因洗涤带的的实验结果误差。在检测时采用了流式激光技术，在测定时是对每个微球进行检测，防止标本中的异抗原（抗体）的干扰。 　　1.2.4标本用量小 由于在同一个反应孔中同时检测多种指标，与其它方法相比明显减少了标本用量，非常适合稀有标本与儿童样本的检测。 　　2液相芯片技术的应用进展 　　液相芯片技术是迄今为止被美国食品药品管理局（FDA）惟一批准用于临床诊断的生物芯片技术。到2005年全球获得FDA认证的液相芯片项目已近200个。其全球最达的检测平台为美国Luminex公司和荷兰的QIAGEN跨国公司。而在美国Luminex公司生产的Luminex检测系统上，目前已有国内生产的商品化试剂供应：比如上海透景公司生产的肿瘤标志物检测产品、HPV检测产品。另外多种研究者根据研究需要自行制备探针微球交联微球，建立反应体系对各种标本进行检测。目前液相芯片技术应用主要是用于抗原--抗体反应的液相蛋白芯片和用于核酸杂交的液相基因芯片。在国内的应用主要涉及以下几个领域。 　　2.1在细胞因子检测方面的应用 细胞因子是T细胞产生的一大类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。因此同时检测多种细胞因子可以全面判断机体免疫功能，在疾病的诊断、病程观察及疗效评价方面有重要意义，还能用于研究发病机制与药物作用的机理。 　　目前临床上常用ELISA法检测细胞因子，这种方法存在一些局限性：一个试剂盒仅能检测一种因子、检测的线性窄，高浓度标本需稀释后才能进行检测。同时标本用量较大，不利于临床开展，常用于实验研究。 　　吴容等采用液相芯片法检测了过敏性紫癜患儿血浆中的IL-2、IFN-r、IL-4水平。在HSP患儿急性期 Th1类细胞因子IL-2、IFN-r水平降低，Th2类细胞因子 IL-4水平增高。陈士岭等采用Luminex液相蛋白芯片检测着床窗期子宫内膜和早孕蜕膜基质细胞的细胞因子水平，用Lumine