亲和层析一步纯化IgM类单克隆抗体.docVIP

亲和层析一步纯化IgM类单克隆抗体嚷克休通讯1989年第一(譬苹26朝J:6一 亲和层析一步纯化IgM类单克隆抗体 玉芳范春荣黄劲松 (一胃药.I1,生物一硷童所,七京) 本文夼绍j用免抗鼠IgM血清制备的亲知层沂柱从小鼠腹水中一步提纯单克隆 抗体IgM的方法提纯的IgM压用琼脂糖电泳检测为一个区带应用迁碌条件下的 SDS—PAGE拴测分离为分子量～80K的重链和～25K的轻篷两条医带,几未见 其他鲁带;应用免疫印米法鉴引.进一步确证IgM,不合常见的鲁质IgG.实验 过程还发现提她的IgMT-够稳定,在贮存过程有降解现象.另外厘用同一亲和柱从 吸附IgG后的小鼠血清中提取多克隆抗体IgM的砬襄也是良好的,经用还原条件下 的SDS—PAGE检测,同样也只分离为轻童链两睾匡带,未见混有其他奈蛋白. 随着单克隆抗体(McAb)的广泛应用.对其研究也日益深入,但含McAb的细胞培养 上清腹水和血清中含有大量的杂蛋白和其他犬分子物质使McAb的研究和应用受到一定 的限制,固而常需进行纯化各实验室制备的McAb最常见的为IgG类和1gM类抗体,一般来 说,提纯IgG类抗体的方法较多,操作较简易,而igM类抗体的纯化就较困难,常用的方法 是凝胶过滤法如Nicholas等(1982)”?和Bamp;livet等(1984)报道的方法,撵作都较繁锁, 提取的IgM纯度也不高;亲和层折法虽是提取IgM的简易有效法,又常受难于得到理想免疫吸 附荆的限制而无法采用我们于1986年采用一个简易微量法研制成功了兔抗鼠IgM血清:, 为采用亲和层析法提取IgM创造了必要的条件,用该法一步提纯的IgM经琼脂糖电泳分析为 一 条区带SDS—PAGE(还原)分离为重链和轻链两条区带.几乎未樯出其他杂蛋白区带 材料和方法 ～ 材料来源McAbJgM系兰州生物制品研究所赠送的HBsAgMcab小鼠腹水正 常小鼠血清为昆明}1小鼠血清:SF2/0瘤株小鼠腹水,本所茁苗二室制备;免抗鼠IgM血清, 本实验室研制:辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG血清丹麦Kern—En—Tee产品:硝酸纤维膜 (卜C)浙江黄岩化工厂产品;其他化学试剂为分析纯级. =,抗鼠IgM亲和屡折柱的制备免抗鼠IgM血清8m{经50饱和度硫酸胺粗提后, 用D.1MNe,HCO3—0.5MNaCI透析平衡,J52.5gCNBr活化Se!ab;arose4B(瑞典Pha— illarcia产品)偶联,操作参照其使用说明书进行,然后装柱(1×11CEl1),用流洗缓冲渡 (o.01MTris—HC】_0.001MEDTA一0.1MNaCIpH7.6)平衡待用 三,蛋白含量测定分光光度法,280rim波长测光密度值(oD) 四HBsAg抗体活性测定血凝法,血球诊断试剂系北京生物制品研究所生产. 五,琼脂糖电泳用0.06MpH8.6巴比妥缓冲液配制l琼脂糖凝胶,按常规浇板 打孔电泳染色脱色. 67 六,sDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(还原)参照fJeamm(A(1970)”方法进行? 分离胶浓度为10或l3%. 七,免疫印染参照Towbi(1979):方法进行,先将抗原采用SDS—PAGE(还 原)分离,再应用LKB2005Transphor电转移仪将聚丙烯酰胺凝胶上己分离的抗原区带转 移至硝酸纤维素膜(NC)上,用2吐温20封闭,加相应的第一抗体(适当稀释)冰箱过夜 次日洗涤后,加辣根过氧化物酶标记第二抗体(5O0~IOOU倍稀释)室温培育l一2小时.再 加二氨基联苯胺底物液显色,换蒸馏水终止反应,观察结果 结果和讨论 一 ,IgM类McAb的提取 将HBsAgMcAbIgM小鼠蝮水2ml加于抗鼠IgM亲和柱上,待样品完全进胶后置冰箱 过夜,使其充分吸附,次日取出用0.01MTris-HC1—0001MEDTA一01MNaCIpH7,6缓冲 液充分流冼,除去未结合的蛋白,换用01M甘氨酸一HC1pH24缓冲液洗脱吸附蛋白,分管 收集,每管约4m1,并立即用lNNaOH调pH至6.0L右,测OD及HBsAB抗体活性,由图 l看出冼脱液中含单一蛋白锐峰,经活性测定为HBsAg抗体. 1? 3? 号4. 图lMcAbIgM的洗脱蟑 =.提纯IgM的琼脂糖电泳 图2提纯McAbIgM的琼脂电泳 由于TgM的分子量比较大,故提igVJ后的标本采用无分}筛效应的琼脂糖电泳进行.并 同时用HBsAgMcAhIgM/]~鼠腹水,正常小鼠血清及鼠血清IgG作对照分析结果见图2. 可看出提纯的IgM除加样孔左侧呈现一条区带外,未检出对照媛水中的其他蛋白医带,以 及与主要泳动在加样孔周围的鼠血清IgG也完全不同,表明经亲和星析提取出单一.的IgM 类McAb 舳 M 愎 叫 地嘴椽 三,提纯ticAbIgti的SDS(还原