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球茎甘蓝小孢子培养胚诱导与植株再生研究 　　摘 要：以10个球茎甘蓝品种（系）为试材，采用游离小孢子培养方法，研究胚状体发生及其再生植株获得方法。研究结果表明，添加适量6-BA不仅使胚诱导成功率达到了100％，还显著提高了出胚率；胚状体发育程度和整齐度与基因型及每皿出胚数有关；子叶期为最佳的转接时期；MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA是最适的成苗培养基。 　　关键词：球茎甘蓝；小孢子培养；胚状体；植株再生 　　 球茎甘蓝（Brassica oleracea L. var. caulorapa DC.）又名苤蓝，营养丰富，是制作腌菜的重要原料，近年来鲜食用量呈上升趋势。但目前国内主要栽培种为常规种，种性退化严重，无法与国外的优质品种竞争，所以选育具有自主知识产权的球茎甘蓝杂交新品种是亟待解决的问题。利用游离小孢子培养技术进行亲本纯化，可以快速获得亲本材料，缩短新品种选育年限。自Lichter[1]首次报道获得甘蓝型油菜小孢子胚及再生植株以来，很多学者对十字花科蔬菜小孢子培养过程中的影响因素进行了研 　　究[2～4]，但迄今为止，国内还未见球茎甘蓝小孢子培养植株再生的相关报道，试验以10个球茎甘蓝品种（系）为试材，对影响胚诱导和植株再生的因素进行系统研究，并获得了大量胚状体和再生植株。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　 供试材料为10个球茎甘蓝品种（系）：川岛脆、河东大苤蓝、东川苤蓝、天津青苤蓝、大青皮芋头、玉冠、早冠、天津白苤蓝、H和P3。2008年8月中旬播种于穴盘育苗，9月初定植到冷棚中，11月下旬移入阳畦越冬，2009年1月中旬移栽至温室，花期取材培养。 　　1.2 试验方法 　　 花期选取长2.5~4.5 mm的花蕾分离小孢子，分离纯化和悬浮培养过程参照栗根义等[5]和姜凤英等[6]采用的方法，稍有改良。 　　 ①分别在A：1/2 NLN-13；B：1/2 NLN-13+0.2 mg/L 6-BA；C：1/2 NLN-13+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 　　3种培养基上对10个试材进行培养，分析植物生长调节剂对胚诱导的影响。 　　 ②以川岛脆、H、P3、天津白苤蓝为试材，在其他培养条件相同的情况下，分析基因型对胚状体发育的影响。 　　 ③以川岛脆、P3为试材，在其他培养条件相同的情况下，分析每皿胚数对胚状体发育的影响。 　　 ④以H各发育时期的胚状体为试材，分别接种于MS＋3%蔗糖＋0.8%琼脂培养基上，置于25℃，光照12 h/d，光强6 000 lx的培养室中培养。分析胚状体发育状态对胚成活的影响。 　　 ⑤以H的子叶形胚为试材，接种于添加不同浓度6-BA和NAA的MS＋3%蔗糖＋0.8%琼脂培养基上，6-BA设0.2，0.5，1 mg/L 3个浓度，NAA设0.05，0.1 mg/L 2个浓度，空白处理为对照，总共6个处理，分析植物生长调节剂对胚成活及萌芽的影响。 　　 成活率（%）=（成活胚数/接种胚数）×100% 　　 不定芽诱导率（%）=（萌发不定芽胚数/成活胚数）×100% 　　2 结果与分析 　　2.1 植物生长调节剂对小孢子胚诱导的影响 　　 由表1可知，在1/2 NLN-13基本培养基上，10个基因型中有5个诱导得到胚状体，诱导成功率为50％，添加0.2 mg/L 6-BA后10个基因型均诱导出胚，诱导成功率达到100%，且出胚率显著提高，但再加入NAA后，几乎所有品种出胚率都显著下降，说明6-BA对胚诱导有明显的促进作用，而NAA多数情况下为抑制作用。川岛脆苤蓝出胚率不加植物生长调节剂时最高，添加植物生长调节剂后反而大幅降低，说明植物生长调节剂在诱导中起到了重要的作用，能够扩大基因型反应范围，但不同基因型的反应不同。 　　2.2 基因型对胚状体发育的影响 　　 本试验中获得的胚状体有的能够发育成子叶形，有的则停留在鱼雷形、心形甚至球形不再发育，而且胚状体发育具有不同步性，往往同一皿中会出现几种发育阶段胚状体并存的情况。从表2可以看出，川岛脆的胚状体发育程度最高，整齐度也一致，子叶形胚比例达到了68.9％，显著高于H，P3和天津白苤蓝。天津白苤蓝的发育程度最差，只有3.33％的子叶形胚，大多数为处于发育初级阶段的球形胚和心形胚，说明基因型是影响胚状体发育的重要因素，不同基因型诱导得到的胚状体发育程度和整齐度存在显著差异。 　　2.3 每皿胚数对胚状体发育的影响 　　 观察发现胚状体发育程度和整齐度还与每皿胚数有关。从表3可知，当川岛脆每皿胚数低于60 个时，子叶形胚比例可达80%；而当每皿胚数高于100 个时，子叶形胚比例明显下降，只有24.44%。同样当每皿胚数高于100 个时，P3的子叶形胚比例也明显下降，由34.44％下降到了8.8