五水处理中微生物的种群分离及代谢产物测定综合.DOCVIP

实验五 水处理中微生物的种群分离及代谢产物测定（综合） 一、实验目的和要求 了解生物处理中好氧污泥和厌氧污泥的微生物组成及生态结构，学习摄影显微镜的使用；掌握微生物培养和分离的基本技术；学习厌氧微生物代谢产物测定的基本方法；培养学生自行拟订设计实验方案； 综合性实验，实验时数可安排为4学时。 二、实验设备与仪器 摄影生物显微镜、厌氧培养装置、净化工作台、PCR仪、DGGE仪、荧光显微镜、气相色谱仪、液相色谱仪、气相/质谱联用仪、SBR反应器、蠕动泵、空气浴摇床、分光光度计、高压蒸汽灭菌锅、烘箱、电炉、冰箱、恒温培养箱。 三、实验前准备工作 1. 预习实验指导书实验五的内容。 2. 用SBR反应器培养好氧活性污泥，用厌氧装置培养厌氧活性污泥。 3. 制备好本次实验分离用的培养基和无菌水、无菌器皿。 4. 实验前学生提交生物相观察的实验方案和实验步骤。 四、实验注意事项 1. 实验中使用的精密仪器，如摄影显微镜、气相色谱仪等应在教师指导下按照仪器操作规程进行。 2. 实验中注意安全操作。学生在使用净化工作台进行无菌操作过程中，严禁使用净化台中的紫外灯。 五、实验原理 1. 微生物培养原理：微生物培养时，应根据微生物的营养类型选择相应的培养基。细菌总数是指水中腐生细菌的数量，培养基应选择适合异养性细菌生长的营养琼脂培养基。 2. 微生物分离原理：混合种群中不同微生物分离，常采用十倍稀释法或划线分离法。根据微生物的营养特征选择适当的培养基采用十倍稀释法或划线分离法将混合种群微生物分离成单个细胞，再在适当培养基上进行培养增殖。 3. 微生物活性测定原理：水处理中微生物的活性，可以由微生物代谢产物的数量和生成速率表示。当水处理中水质或环境条件改变，微生物代谢产物数量和种类将发生变化。厌氧污泥的活性可以通过水中代谢产物和气体代谢产物的测定表示。水处理好氧活性污泥的活性可以用淀粉酶数量表示。淀粉酶高，淀粉分解速度快，微生物活性强。淀粉遇碘变蓝，淀粉分解后，蓝色消失。 4.微生物生态结构测定原理：好氧微生物或厌氧微生物都是有不同种类微生物组成的微生物群落，共同作用完成生物的代谢功能。通过提取微生物的DNA，分析其微生物组成，可以得到有哪些微生物群系组成。 六、实验内容 1. 好氧污泥和厌氧污泥的生物相观察，用摄影生物显微镜记录生物相内容。 2. 微生物分离和细菌总数的测定 3. 厌氧微生物代谢产物的测定 4. 好氧微生物的生态结构（运行实验） 七、实验方法与步骤 1.好氧污泥和厌氧污泥的生物相观察 1）分别取在SBR反应器中培养的好氧污泥和在UASB反应器或厌氧培养装置中培养的厌氧颗粒污泥进行生物相观察，并在显微镜下分辨其微生物组成及形态特征。 2）每组使用摄影显微镜拍摄生物相图，提交并保存在实验室计算机中。 3）实验前，学生自行拟订实验方案和实验步骤，交指导教师检查。具体操作步骤可参见实验一、实验二。 2. 好氧（或厌氧）微生物分离 （1）稀释平板分离法 1）稀释水样：取好氧活性污泥（和厌氧污泥）在无菌操作条件下用十倍稀释法稀释，方法如下： ①将1瓶90 mL和5支9 mL无菌水放在试管架上，按10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6依次编号。 ②在无菌操作下，用10 mL无菌移液管取10 mL污泥放入90 mL无菌水的三角瓶中（内含玻璃珠），将移液管吹洗3次，手摇10分钟打散样品，即为10－1浓度菌液。移液管吹洗3次，摇匀即为10－2浓度菌液。 ③再用1 mL无菌移液管取1 mL10－1浓度菌液于一管9 mL无菌水中。同样方法，依次稀释到10－6。 2) 平板的制作 取7套无菌培养皿编号，10－4、10－5、10－6各2个，另1个为空白对照。在无菌操作条件下，用1ml无菌移液管从浓度小的开始，以10－6、10－5、10－4顺序分别取0.5ml菌液放入相应的培养皿内，再加15mL约45℃融化的培养基，将培养皿平放在桌上，来回转动培养皿，使培养基和菌液混匀，凝固后成平板，倒置于培养箱中，在恒温30 （2）平板划线分离法 1）将50℃ 2）取好氧污泥（或厌氧污泥*）在无菌条件下用平板划线法别接种在培养基上→在恒温30℃ *为选做项目 3. 厌氧微生物代谢产物的测定 （1）用250 ml盐水瓶取20 mL 厌氧污泥→ 加无菌水至100 mL → 加入0.5 g 蔗糖→ 测定初始条件下挥发性脂肪酸浓度→ 密封→ 放入空气浴摇床中在20－25oC培养 （2）培养24小时→ 应用排水法测定气体产量后取水样→ 测定挥发性脂肪酸浓度，并应用气相色谱仪分析溶液中有机酸的组成。 （3）取厌氧消化中气体用气相色普分析消化气的成分。 （4）平行条件下做一空白对照 （5）分析代谢产物的组成，(分析气体和挥发性脂肪酸生成速率),判断消化气的热