肝康ⅳ号对脂肪肝大鼠肝组织脂质、sod、mda及tgf-β-2c1-含量的影响.pdfVIP

湖北中医学院2006届硕士研究生毕业论文 湿重，并记录，然后在肝脏最大叶边缘0．5cm处取小块肝组织冰生理盐水冲洗， 滤纸吸干，称取o。59置于预冷的5ml生理盐水，迅速周内切式匀浆机10000r／min 0％的肝匀浆，再用高 匀浆1O秒／次，间隙30秒，连续3次，碎冰块中制成1 速冷冻离心机4℃，3000r／min离心10分钟，取上清3ml密封，一20℃冷存待检。 x O％甲醛固定 另在肝脏不同部位分别取1 1×O．5cm大小肝组织3块，浸泡于1 液固定，送病理科检查。 3观察指标及检测方法 3．1形态学观察 3．1．1实验大鼠肝脏的肉眼表现及病理形态学观察方法 肉眼表现为取材后直接用肉眼观察，病理形态学先脱水石蜡包埋，切片，HE 染色，再光学显微镜观察下观察肝脏组织形态学改变(郧阳医学院附属人民医院 病理科协助检测)。 3．1．1实验大鼠肝脏病理形态学观察标准及积分标准(参照文献“1)： 轻度：光镜下每单位面积1／3以上肝细胞脂肪变； 中度：光镜下每单位面积2／3以上肝细胞脂肪变； 重度：光镜下几乎所有肝细胞均发生脂肪变； 肝细胞脂肪变性：部分肝细胞内虽有少量脂滴沉积，但不足脂肪肝的诊断标 准。 肝脏肉眼表现积分标准 积分 形态改变状况 O 肝脏外形正常，暗红色，包膜光滑，边缘锐利，质韧 1 肝脏体积增大，呈淡黄色，包膜光滑，边缘锐利，质韧 2 肝脏体积增大，呈黄色，包膜紧张，边缘变钝，质韧 3 肝脏体积增大，呈黄色，包膜紧张，边缘变钝，切面油腻，质软 3．2血清AST、ALT、和肝组织TG、TC的检测 由郧阳医学院附属人民医院检验科用金自动生化分析仪协助检测。 3．3s0D，MDA的检测 3．3．1肝组织蛋白含量测定：取10％的肝匀浆lml用生理盐水按1比9稀释成1 ％的肝匀浆，然后在空白管、标准管和测定管分别加蒸馏水、19／1的蛋白标准 液和肝组织匀浆各O．05ml，然后各管均加入考马斯亮兰显色剂3ml，混匀，静置 10分钟，于59 5nm处，1cm光径，空白管调零，测各管吸光度。最后根据公式蛋 白含量(g／L)=测定管吸光度／标准管吸光度×标准管浓度(g／L)。 3．3．2肝组织s0D测定(黄嘌呤氧化酶法)：取10％的肝匀浆lml用生理盐水按 1比9稀释成1％的肝匀浆，在测定管和对照管按试剂说明书逐步添加试剂，取 9 湖北中医学院2006届颂士研究生毕业论又 ml，混匀， 样量为30ul，待在充分混匀，置37℃恒温水浴40分钾后加显色剂2 室温放置10分钟后，于波长550nm处，1cm光径，空白管调零，测各管吸光度。 计算公式soD活力(u／mgprot)=(对照管吸光度一测定管吸光度)／对照管吸光 度÷50％×反应液总体积／取样量(m1)÷组织中蛋白含量(mgprot／m1)。 3．3．3肝组织MDA测定(硫代巴比妥酸法TBA)：按说明书推荐简便法操作，先 配混和试剂，然后在标准管、标准空白管和测定管中分别加入10nmoml／ml的标 准品、无水乙醇、10％的肝组织匀浆各o．2ml，最后每管中均加入混和试剂4m1， 混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40分钟，取出后流水 冷却，然后3500转／分，离心十分钟，取上清1m1，于波长532nm处，lcm光径， 吸光度)／(标准管吸光度一标准空白管吸光度)×标准品浓度(10nmoml／m1) ÷组织中蛋白含量(mgprot／m1)。 3．4肝组织TGF—p。的检测(免疫组化法) H 3．4．1检测方法大鼠肝组织常规石腊包埋，切片厚4m，采用sABc免疫组织化 学染色法进行。阴性对照，以PBs代替一抗，显微镜观察蛋白的表达，采用图像 处理系统分析其数目，步骤如下：