免疫分析法_课件.ppt

有机溶剂的选择 选择有机溶剂的原则： ①有机溶剂的水溶性好； ②沉淀效率高； ③毒性小，避免损害工作人员的健康和污染环境； ④不与溶质分子发生化学反应，价格便宜。 使用较多的是乙醇、丙酮、甲醇等。 残留的有机溶剂去除的方法： ①自然蒸发或负压蒸发，可在室温进行； ②凝胶过滤除去。 （三）离子交换层析法 离子交换层系（ion exchange chromatography， IEC）是利用离子交换剂上可交换离子与组分中的离子发生可逆交换时结合力的差别，而进行分离的一种技术。广泛应用于很多生命物质的分析、制备和纯化等。 优点： ①重现性好，简单易行； ②分辨力强，回收率高； ③具有多孔性，表面积大、交换容量大； ④具有亲水性，对大分子的吸附不牢固，层析条件温和，不致引起物质变性或失活。 离子交换法的固定相是离子交换剂； 若担体带有正电荷，可吸附着负电荷分子，则为阴离子交换法；不带净电荷的分子，以及阳离子则直接流出，不会被吸附上去。 这些被固相单体所吸附的离子，统称为 counter ion，因为其电荷与担体上的电荷相反 (counter 是 相反 的意思) ? 离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。它可分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。 基本原理 阳离子交换反应：R-A- H+ + Y+ —R-A- X+ + H+ 阴离子交换反应：R-B+ OH- + X- —R-B+ X- + OH- R代表离子交换剂的高分子聚合物基质， A- 和B+分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团， H+ 和OH-分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子， Y+ 和X-分别代表溶液中的离子基团。 两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。 大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活，应尽量避免。 洗脱可采用改变溶液的pH或离子强度，也可同时改变pH与离子强度的方法。改变pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱。 用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。 在阴离子交换柱上血浆蛋白组分的分段洗脱 NaCl(mol/L) 0.01mol/L PB的pH 洗脱的蛋白质 0.025 8.0 IgG 0.030 7.0 IgG 0.035 7.0 IgG、转铁蛋白、纤维蛋白原 0.040 7.0 转铁蛋白、纤维蛋白原 0.045 7.0 α2蛋白、白蛋白 0.050 7.0 IgA、α2蛋白、白蛋白 0.060 6.5 IgA、白蛋白 0.070 6.5 白蛋白 0.080 6.5 α2蛋白、β-脂蛋白、白蛋白 0.090 6.5 α2蛋白、珠蛋白、白蛋白 0.10 6.5 α2蛋白、β-脂蛋白、珠蛋白、白蛋白 0.15 6.5 IgM、β-脂蛋白、β球蛋白 0.20 6.5 铜蓝蛋白、β蛋白 三、技术要点 （一）离子交换剂的选择和处理 两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。 大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活，应尽量避免。 处理的目的：使交换剂充分溶胀，使其颗粒的孔隙增大，让具有交换活性的电荷基团充分暴露出来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需要的反离子。 （二）装柱和加样 选择平衡缓冲液的离子强度和pH时，首先要保证待分离物质的稳定；其次是使离子交换剂与待分离物质有适当的结合，而不与样品中杂质结合，以达到分离的目的。 溶液的离子强度常用不影响蛋白质吸附到交换剂上的最高离子强度液，常用的离子强度为20 mmol/L ~50 mmol/L NaCl。 （三）洗脱和收集 洗脱可采用改变溶液的pH或离子强度，也可同时改变pH与离子强度的方法。改变pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱。 用一定盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。 （四）离子交换剂的再生与保存 使其带上所需的平衡离子。 （四）亲和层析法 亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性的一种高度专一的吸附层析类型。 配体是发生亲和反应的