细菌分类试验技术ppt课件.pptVIP

MLST的优点： 分辨率高，可以分辨出各基因的所有变异，避免了MLEE中的不确定因素 核苷酸序列提交到特定的网站，通过互联网可以实现资源共享 可以研究各物种的群体遗传和生物进化 为微生物分类学家寻找16S rDNA以外的分子作为系统发育“进化钟”提供了依据 目前这些保守的基因序列主要包括：atpD，recA，dnaX，glyA，recN，atpA，rpoA 等（Zeigler 2003）。由于这些保守基因位于染色体的不同位置，根据这些基因序列也许可以预测不同细菌的基因组组成的相关性，进而可以代替细菌分类中重要的、操作复杂的DNA 同源性分析技术 不同基因序列相似性达到多少可以反映其相应DNA同源性的水平，仍需要通过大量的序列信息进行比较研究，进而利用数学统计方法建立起两者之间良好的相关性，才能够进一步更广泛的应用到细菌分类研究中 一．DNA碱基组成分析 二. DNA-DNA杂交 2.4 基因组DNA同源性分析 DNA-DNA同源性分析及G+C mol%的测定已成为细菌分类鉴定中的基本方法，并已成为描述细菌分类单元的一个标准。 国际系统细菌学委员会规定，DNA同源性≥70%、热解链温度差ΔTm≤5℃为细菌种的界限(Wayne et al. 1987)。 由于这一界限过于严格，Ursing等(1995)认为DNA同源性在50～70％以上、ΔTm在5℃～7℃以下为种群的界限。一般来说细菌种内菌株之间的DNA G+C mol%差别不大于3％，属内差别不大于10％（Stackebrandt Liesack 1993）。 一、 DNA G+C mol%测定 每种生物都有特定的DNA G+C mol%含量，细菌的DNA G+C mol%含量变化较大，可达到25～80％。不同细菌类群，其G+C mol%也不同。 同种的细菌G+C mol%含量变化较小，比较稳定， 不受菌龄、生长条件等外界因素的影响。 G+C mol%是细菌分类与鉴定的一个重要指标。 G+C mol%含量的作用主要在于“否定” 一般认为 同种内不同菌株的DNA G+C mol%的差异不大于4-5%， 同属不同种的差异不大于10%。 如果两个菌株的DNA G+C mol%差异大于5%，就可以判断这两株菌不属于同一个种。这时，DNA G+C mol%这项实验的判断价值要比形态和生理生化实验的价值都大，甚至在其它性状相似的情况下，也可以做出这样的判断。 操作简便、精确度高、重复性好、常用 当天然双链DNA分子在一定的离子强度和pH条件下逐步加热使温度升高到一定值时，碱基之间氢键不断打开，互补的DNA双螺旋不断变成单链，导致在260nm的紫外吸收明显增加(即增色效应)；当双链DNA完全变成单链后，紫外吸收值停止增加。 实验原理 在热变性过程中，双链DNA解开一半时所对应的温度值，为热解链中点温度(Tm值)。 Tm值随G+C mol%的增加而增加，因为在G≡C碱基对中含3个氢键，在A=T碱基对中含有2个氢键；破坏G≡C对比破坏A=T对需要更高的温度。这样，Tm值可反映不同细菌的DNA G+C mol%含量。 G+C含量每增加1％，Tm值随之增加0.4℃ Tm值测定最主要的影响因素是溶液的离子强度。 单价阳离子浓度每增加10倍， Tm增加16.6℃。 DNA分子量对Tm值基本无影响。 Tm值测定的影响因素: （一）实验菌株及其培养 实验菌株(Agrobacterium sp., Rhizobium sp.)， YMA斜面活化后， 接种于TY培养液中, 28℃振荡培养, 至对数中后期， 确定无杂菌污染。 实验材料及步骤 菌体收集 将培养至对数中后期的菌体，5600rpm，15min，4℃离心收集。用1×TES悬浮菌体，同样条件下离心、洗涤3次。 考评项目赋标准分，对照考评内容和考评办法对考评项目进行考评，评出各考评项目的考评实际得分，考评类目下各考评项目考评实际得分之和为该考评类目的考评实际得分 分类方 法 原理 应用 评价 文献 数值分类* 利用“等权原则”，对大量表型性状进行量化，辅助计算机进行聚类分析，得到表观群 对大量未知菌株初步分群，80%左右的相似性水平划分种群 与DNA杂交结果较一致，提供种群表型特征；工作量大，费时、费力，人为影响大，各实验室结果无法比较 Sneath Sokal 1973; Sneath 1984; Graham 1964; Gao et al. 2004; Yao et al. 2002 全细胞蛋白电 泳 蛋白质是基因的表达产物，不同的细菌蛋白质组成存在差异， 蛋白质电泳图谱差异反映基因组成的不同 种和种以下水平的初步分群