仪和凝胶成像系统课件.pptVIP

泸州医学院药理毒理研究室 一是作为领导干部一定要树立正确的权力观和科学的发展观，权力必须为职工群众谋利益，绝不能为个人或少数人谋取私利 仪器分析实验——分子生物学实验技术 药学院：刘明华 内 容 PCR的反应原理及反应体系 PCR示例 凝胶成像系统 多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种在体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。 体内DNA的复制体系 DNA聚合酶（I II III） 拓扑异构酶 解旋酶类 SSB 引物 dNTP Mg2+ 5’ 3’ 模板 Mullis的PCR构思 引物 引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 模板 Mg2+ dNTP thermus aquaticus Taq DNA多聚酶的发现 1988年Saiki 等从温泉（?Hot?spring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process… PCR反应条件 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 变性 退火 延伸 温度三点法 温度、时间和循环次数。 PCR反应条件 变性 使双链DNA解链为单链 94℃， 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合; 降低温度可增加反应的灵敏性。 一般为45～65℃, 30秒 PCR仪 （3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定，1分钟扩增1Kbp （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 PCR的基本原理 PCR的基本原理小结 变性、复性、半保留复制 一生二，二生四，四生万物 PCR三步曲 变性 90～97℃ 退火 45～65℃ 延伸 70～75 ℃ PCR过程 实时荧光定量PCR仪 梯度PCR仪 普通PCR仪 用途广泛 生命学科 肿瘤 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学 PCR示例 一、实验目的 学习PCR分析的原理与技术。 二、实验材料、仪器和试剂 1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18-T 质粒DNA 2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备 3、试剂： 10XPCR 反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1和引物2 1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 2.0μL 10mmol/L dNTP 1.0 μL 10μmol/L 引物1 1.0 μL 10μmol/L引物2 1.0μL 质粒DNA 1.0 μL Taq 0.1 μL(5U) 水补充至 25.0 μL 三、操作步骤 ⑴94~96℃ 30’’-3’ 预变性（使模板充分变性） ⑵94℃ 30’’ 变性 ⑶45-65℃ 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） ⑷72℃ n’ 延伸 (按1’扩增1kb计算） ⑹72℃ 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） ⑺4-10℃ 保存 25-35 个循环 2.将反应体系放到PCR仪中扩增，PCR反应程序设置为 英国Techne多功能型PCR仪TC-412 3.反应完成后,将