棉花亲环素基因ghcyp1与ghcyp2功能初探-preliminary study on the functions of gh cyp 1 and gh cyp 2 gene in cotton.docxVIP
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棉花亲环素基因ghcyp1与ghcyp2功能初探-preliminary study on the functions of gh cyp 1 and gh cyp 2 gene in cotton
石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明
学位论文独创性声明
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摘 要
棉花是世界上最重要的经济作物之一。在农业生产中,棉花经常遭受干旱、盐碱、 低温等逆境胁迫,影响棉花正常的生长发育,使产量和品质下降,造成严重的经济损失。 亲环素(Cyelophilins,Cyps)是一类广泛分布于动物、植物、真菌及原核生物等几乎所 有生命体中的蛋白家族,它能够参与蛋白质的折叠、免疫抑制及细胞信号转导等多种生 物学过程。大量研究表明,亲环素在植物中还能够参与植物体的生长发育,叶绿体的光 保护和氧化还原调节,并在植物体胁迫应答及抗病原体免疫等方面发挥重要的作用。本 研究对克隆获得的两个棉花亲环素基因GhCYP1和GhCYP2在棉花不同组织器官中的表 达模式进行分析,并通过转基因烟草进行功能初步研究。研究结果如下:
1、在实验室前期已经获得GhCYP1基因cDNA序列的基础上,利用Gateway技术构建 GhCYP1 的 植 物 表 达 载 体 pGWB-GhCYP1 , 通 过 农 杆 菌 介 导 的 遗 传 转 化 技 术 获 得 转 GhCYP1基因烟草植株。对转基因烟草进行水分、盐、低温胁迫后,转基因烟草植株叶 片比野生型出现萎蔫症状的时间推迟、程度较轻,复水后恢复快,转基因烟草叶片的相 对含水量、丙二醛含量、相对电导率各种生理指标都显著优于野生型烟草,转GhCYP1 基因烟草显示出较强的抗逆能力。构建GhCYP1基因蛋白表达载体pET28a-GhCYP1,转 化大肠杆菌DE3菌株。在转化菌液中加入IPTG诱导后,提取蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳,在18KD处出现了目的蛋白质。
2、以小麦亲环素wCyP3(AF262984)基因的蛋白序列为探针,在GenBank中与棉 花EST序列进行tBLASTn比对,将同源性高的EST序列拼接后获得一条长912bp的cDNA 序列,RT-PCR扩增获得该cDNA序列,序列分析确认为植物亲环素基因序列,并将基因 命名为GhCYP2(GenBank登录号:JN032296)。
3、利用实时荧光定量 PCR 技术对 GhCYP2 基因在棉花不同组织器官和不同发育天 数纤维的表达量进行分析,结果表明 GhCYP2 基因在根、茎、叶、花、胚珠和纤维细胞 中均有表达,在叶以及开花后 18 天的纤维中表达量最高。对棉花低温胁迫 0h、1h、6h、 12h、24h、48h、72h 后,利用半定量 RT-PCR 技术对其表达量进行检测,发现在胁迫
12 小时后该基因表达量达到最高,48 小时后表达量降低。利用 Gateway 技术构建 GhCYP2 的植物表达载体 pGWB-GhCYP2 和干扰载体 pANDA-GhCYP2,侵染拟南芥并筛选转基 因植株,为明确其在应对逆境胁迫中的作用机理奠定基础。
关键词:棉花;亲环素;实时荧光定量PCR;烟草转化
Ⅱ
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Abstract
Cotton is the main cash crop in the world. cotton often suffers from drought, saline and low temperature stress during agricultural production, and normal growth and quality deduction, and leading to severe economic loss. Cyclophilin(Cyelophilins, Cyps) is a protein family that widely distributes in nearly all of the organism including animals, plants, fungi and prokaryotes. Cyps are involved in protein folding, immune suppression and cell
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