生药鉴定显微 课件.ppt

第四节 显微鉴定 ;一、显微鉴定的常用方法;切片类型;解离组织片：可用氢氧化钾法，使细胞间质溶解，细胞分离后观察目的物。 表面片：叶、花、果实、种皮等多用，可观察各部位的表皮特征。;粉末片： 水合氯醛透化片； 水合氯醛不透化片； 醋酸甘油片或稀甘油片或水装片。 磨片：观察矿物药，相当于固定 片。 ;(十四)中成药显微鉴别要点 ;生药的粉末鉴定研究对于中成药的科学鉴定有重要作用。 1．了解组方生药、剂型和制法 熟悉处方中组成药物的显微特征是中成药鉴别的基础。 中成药的显微鉴别要比中药材粉末鉴别复杂得多，制备方法及辅料等会产生一定的影响和干扰。 ;2. 根据处方明确专属特征 中成药显微鉴定，一般根据处方，对各组成生药粉末特征作分析比较，选取各药具专属性的显微特征，作为鉴别依据。;六味地黄丸是由熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻六味药组成，每味药都有数个显微特征，大部分特征又有横向类别的交叉。选取六味药各具专属性的显微特征，这样六味药物均可鉴别。;三、扫描电镜等的应用 ;偏振光显微镜;例如： 淀粉：在偏光显微镜下呈现黑十字现象，不同类型的淀粉其黑十字形象不同； 草酸钙结晶：类型多样，在偏光显微镜下呈不同的多彩颜色；;石细胞：在植物体内广泛分布，其细胞壁在偏光显微镜下呈亮黄色或亮橙黄色； 纤维、导管、矿物类物质：在偏光显微镜下则呈强弱不同的色彩； 动物的骨碎片、肌纤维、结晶状物、毛茸等也呈现出不同的偏光特性。 ;;麝香仁（显微）;2．扫描电子显微镜（扫描电镜） 扫描电镜分辨率高，放大倍率5倍～10万倍，能使物质的图像呈现显著的表面立体结构(三维空间)的特征，观察的样品制备操作又较简易，所以在生药鉴定，特别在同科属种间的表面结构的鉴别比较上，成为一种新的手段。 ;扫描电镜下的细菌;第五节 理化鉴定 ;理化鉴定;常用的理化鉴定方法 ;多在试管中进行，或在生药切面或粉末上滴加各种试液，观察呈现的颜色以了解某成分所存在的部位。 沉淀反应： 利用生药某些化学成分能与某些试剂产生特殊的沉淀反应来鉴别。 泡沫反应和溶血指数的测定;微量升华 利用中药中所含的某些化学成分，在一定温度下能升华的性质，获得升华物，在显微镜下观察其结晶形状、颜色及化学反应作为鉴别特征。 ;显微化学反应(microchemical reaction) 将生药的干粉、切片或浸出液少量，置于载玻片上，滴加某些化学试液，使产生沉淀或结晶，在显微镜下观察反应结果；或观察所产生的特殊颜色。 ;荧光分析 利用生药中所含的某些化学成分，在紫外光或自然光下能产生一定颜色的荧光性质进行鉴别。 例如 黄连饮片显黄色荧光； 浙贝母粉末显亮淡绿色荧光； 大黄粉末显深棕色荧光。;色谱法 常用以下三种色谱法： 薄层色谱法(TLC) 气相色谱法(GC) 高效液相色谱法(HPLC) ;分光光度法 紫外分光光度法 可见分光光度法 红外分光光谱法 原子吸收分光光度法 ;第六节 DNA分子标记鉴定 ;生药鉴定常用的DNA分子标记方法 ;二、DNA遗传标记技术的方法及原理;用放射性同位素标记的DNA探针检测与被标记DNA相关的片段，构建多态性图谱。 该方法试验步骤繁琐(包括southern转移、探针标记、杂交、检测等)，又受到探针来源的限制，所需DNA样品量大。 ;2．聚合酶链式反应(PCR，Polymorase chain reaction) PCR技术是20世纪80年代中期发明的一种模拟体内DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术，又称无细胞分子克隆技术。 ;该方法操作简便、快速、特异、灵敏，不需提纯，不需使用同位素、省去了基因克隆步骤、对植物材料要求不严、用量少； 但该技术所需的一对引物设计，需要知道物种的遗传信息，因而在生药研究中具有一定的局限性。 ; 聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是1985年美国Cetus公司 Kary Mullis等建立的最新生物技术。; 二、PCR的原理 1. PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两端已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸引物（一般长15~30bp），这一单链引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。 2. PCR反应体系由基因组DNA、一对引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必需的离子浓度等组成。; 3. 基本过程是： A. 变性：加热（93℃～95℃ ），使基因组双链DNA变性为单链； B. 退火或称复性 ：通过降低温度（50℃～70℃），使特异性引物与互补的DNA序列特异性结合； C. 延伸 ：发生了互补结合的引物在耐高温（70