玫瑰黄链霉菌men-myco-93-63接合转移体系及nsda基因的分析-analysis of nsda gene and men - myco - 93 - 63 conjugation transfer system of streptomyces roseofluoensis.docxVIP

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2018-07-27 发布于上海
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玫瑰黄链霉菌men-myco-93-63接合转移体系及nsda基因的分析-analysis of nsda gene and men - myco - 93 - 63 conjugation transfer system of streptomyces roseofluoensis

摘要玫瑰黄链霉菌 (Streptomyces roseoflavus) Men-myco-93-63 是分离自马铃薯疮痂病 (S. scabies) 自然衰退土壤中的一株拮抗菌。该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌 (Verticillium dahliae)、瓜类白粉病菌 (Sphaerotheca fuliginea Poll) 等多种重要的植物病原菌具有很强的抑制作用，有着良好的生防应用潜力。为了对玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 中一些功能性基因进行研究，对其进行遗传改造以期得到抗生素高产菌株，本研究建立了该生防菌的接合转移转化体系，并且进一步优化了接合转移条件，获得了较好的转化效果。分别以基因整合型质粒 pSET152 和基因破坏型质粒 pKC1139 为出发质粒，ET12567(pUZ8002，pSET152/ pKC1139 ) 为供体，玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 孢子和菌丝体为受体，选取 MS、 PDA、TSB 琼脂培养基和燕麦培养基为不同的培养基进行接合转移试验。结果表明 MS 培养基为接合转移的最适培养基，经验证，已成功地将质粒 pSET152/pKC1139 转入到了玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 中。以孢子为受体时，孢子预萌发条件为 50℃ 热激 10 min，37℃ 温育 2.5 h，转化效率是 10-7~10-6；以菌丝体为受体时，转化效率是 10-7~10-6，但菌丝培养过程中容易受到污染。另外，抗生素的覆盖时间对接合转移效率的影响较明显，16~18 h 覆盖效果最好。所以最终选择转化体系为：玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 孢子 50℃ 热激 10 min，37℃ 温育 2.5 h，抗生素覆盖时间为 17 h。 nsdA (negative regulator of Streptomyces differentiation) 基因是天蓝色链霉菌(S. coelicolor) 中发现的与抗生素合成相关的负调控基因。根据天蓝色链霉菌 A3(2) 的序列设计引物扩增玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 菌株中的该基因，经测序和序列分析表明，由保守序列引物 nsdA-2R 和 nsdA-2L 克隆到的玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 菌株中的该基因 800 bp 片段与已知 nsdA 基因核苷酸保守区域序列同源性达到 99 %，由全长序列扩增引物 nsdAWZ–R 和 nsdAWZ–L 克隆到的该基因包含一个完整的开放阅读框，共编码 369 个氨基酸，与变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌 A3(2) 中的 nsdA 基因的核苷酸序列同源性达到 100 %，氨基酸序列同源性达到 99 %。该全长基因命名为 nsdAmgh，并用斑点杂交法验证了 PCR 扩增结果的正确性。为进一步研究该基因在玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 中的功能，利用基因破坏型质粒 pKC1139 构建了同源重组质粒 pSRNA800(pKC1139::800bp nsdAmgh) 和 pSRNA2500(pKC1139::1.5 kb nsdAmgh::1.0 kb KmR) 来阻断该负调控基因。将用于基因破坏型重组质粒 pSRNA800 和 pSRNA2500 转化 ET12567(pUZ8002) 获得接合转移供体菌 ET12567(pUZ8002，pSRNA800/pSRNA2500)，通过接合转移导入玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 中，均得到阳性转化子。转化子在高温和抗生素双重筛选压力下，玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 (pSRNA800) 未得到基因中断突变株，而玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 (pSRNA2500) 筛选得到表型为 AmSKmR 的 nsdAmgh 基因中断突变株，并用斑点杂交法验证了突变株中 nsdAmgh 基因已被正确中断。与出发菌株相比，阻断株在摇瓶水平上对棉花黄萎病菌的抑制能力提高了一倍。关键词：玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63；接合转移；pKC1139；pSET152；nsdA基因；基因阻断 Study of conjugal transfer system and nsdA gene of Stremptomyces roseoflavus Men-myco-93-63 Author: Shen fengying Supervisors: Li yaning, Liu daqun Major: Plant pathology Abstract S. roseoflavus Men-myco-93-63 was isolated