棉铃虫单衣壳核型多角体病毒hasnpvorf101性质的初步研究-preliminary study on the properties of helicoverpa armigera monocapsid nuclear polyhedrosis virus hasnpvorf 101.docxVIP

摘要棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒(Helicoverpaarmigerasinglenucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HaSNPV)是一类双链环状DNA病毒，其分子生物学和基因功能研究已取得很大进展。开放阅读框101（openreadingframe101,orf101）是HaSNPV的一个功能未知基因，本文首次对HaSNPVG4株基因组中的orf101进行研究报道。orf101基因及其编码蛋白HA101的序列经过生物信息学软件分析后显示：orf101全长762bp，编码253个氨基酸组成的肽链，预测蛋白质分子量大小为29kDa；orf101起始密码子上游-81位和-49位均存在晚期启动子特征序列TAAG，表明orf101可能是一个晚期表达基因。通过PSI-BLAST比对发现，HA101的同源蛋白在所有已完成基因组测序的鳞翅目及膜翅目杆状病毒中均存在，且HA101及其同源蛋白都含有一个被称作DUF816的结构域，说明HA101及其同源蛋白是一类进化保守的蛋白质家族，很可能在病毒粒子的复制周期中起到极其重要的作用。因此，对HA101的研究具有重要意义。本试验中，我们利用表达载体pGEX-KG将orf101编码蛋白与谷胱甘肽S转移酶（GST）在表达宿主大肠杆菌BL21中融合表达，表达产物约为55.8KDa，与预期的大小相符。表达蛋白经初步纯化（包涵体纯化和凝胶电泳分离相结合），免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。经western-blot检测，获得了特异性较强的抗体，为进一步研究HA101蛋白的表达时相及其在病毒颗粒上的定位打下了基础。同时，我们也探索了GST-HA101融合蛋白的可溶性表达条件，我们发现融合蛋白主要以包涵体形式表达，在我们所尝试的任何条件下可溶性融合蛋白表达量都很低。r为研究orf101的功能，我们通过同源重组在原核水平将该基因orf101敲除，构建orf101基因缺失型重组病毒。首先我们通过构建克隆的方法在pKS-egfp-Cmr质粒Phsp70-egfp-SV40-Cmr两端分别加上orf101的上下游同源臂，然后酶切回收带有同源臂的ha101UP-Phsp70-egfp-Cm-ha101DO线性片段，借助编码λ噬菌体Red-ET线性重组酶系统的质粒pKD46及棉铃虫杆状病毒细菌人工染色体HaBacHz8，在大肠杆菌BW25113中进行同源重组。通过PCR及酶切鉴定，我们得到了orf101缺失型重组病毒HaBac△101。为系统分析orf101在病毒复制周期中的作用，我们利用Bac-to-Bac系统构建了带有绿色荧光蛋白egfp基因和多角体编码基因polyhedrin的三种基因型重组病毒：orf101缺失型重组病毒HaBacKO，orf101回复型重组病毒HaBacRep，野生型对照重组病毒HaBacWt。三种基因型重组病毒的构建，为我们今后在细胞水平上研究orf101对病毒基因组的复制、出芽病毒滴度、包涵体病毒组装等方面的影响打下了重要基础。关键词：棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒；orf101；原核表达；多抗制备；基因敲除Primarystudyofthecharacteristicsoforf101fromHelicoverpaarmigerasinglenucleocapsidnucleopolyhedrovirusAbstractHelicoverpaarmigerasinglenucleocapsidnucleopolyhedrovirus(HaSNPV)isakindoflargedoublestrandedcycleDNAvirus,greatprogresshasbeenmadeinitsmolecularandfunctionalresearch.Openreadingframe101(orf101)isaconservedgene,whosefunctionisunknown.Thispaperreportedtheprimarystudyresultsoforf101.Bioinformaticanaysisshowedthatorf101is762bplong,whichencodesaputativeproteinof253aminoacidsanditspredictedmolecularsizeis29kDa.TheproteinwasnamedHA101.TwolatebaculoviraltranscriptioninitationmotifTAAGwasfoundat-81and-49ntupstreamoftheputativetranslationalstartsiteseparately.TheresultsofPSI-BLASTdispla