绿色木霉as3.3711的egⅲ基因的克隆及在酿酒酵母中的表达-cloning and expression of eg ⅲ gene of trichoderma viride as 3.3711 in saccharomyces cerevisiae.docxVIP

Classified Index: Q933 U.D.C: 579.25 Dissertation for the Master Degree in Science CLOING OF THE ENDO-β-GLUCANASE Ⅲ GENE FROM THE Trichoderma viride AS 3.3711 AND THE GENE EXPRESSION IN Saccharomyces cerevisiae Candidate： Zhou Qi Supervisor： Prof.Yang Qian Academic Degree Applied for： Master of Science Specialty： Biochemistry and Molecular Biology Date of Defence： June, 2004 Degree-Conferring-Institution： Harbin Institute of Technology 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 - - I - 摘 要 为研究构建可直接降解纤维类资源生产燃料乙醇的酵母基因工程菌，本文 以纤维素高效分解菌株绿色木霉（Trichoderma viride）AS3.3711 为出发菌株。 通过 RT-PCR 的方法克隆出绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅲ（EGⅢ）的 cDNA 基 因，构建至克隆载体 pMD18-T 上转化大肠杆菌 DH5α，同时对三种大肠杆菌 DH5α、BL21、M15 的感受态细胞的转化效率进行测试。对克隆出的 cDNA 序列经测序后构建到酿酒酵母诱导型表达载体 pYES2 上，用醋酸锂转化法转 化酿酒酵母 H158（Saccharomyces cerevisiae），转化获得的 EGⅢ转化子经菌落 PCR 和质粒的双酶切鉴定。阳性转化子经 2% 的 β-D- 半乳糖诱导后，用 Northern 杂交、刚果红染色法和 CMC 糖化力法分别进行检测。 实验结果表明，提取的绿色木霉 RNA 完整性较好，纯度较高。经 RT-PCR 法成功地扩增出了绿色木霉（ T. viride ） EG Ⅲ的 cDNA 基因并构建至了 pMD18-T 上。EGⅢ的 cDNA 基因经测序得到其开放阅读框长度为 1254bp，编 码 418 个氨基酸，推测蛋白质分子量为 44.1kDa。采用同种方法制备的三种大 肠杆菌感受态转化效率从高至低分别是：M15 1.5×109，DH5α 2.3×108，BL21 1.5×103 个转化子每 μg pUC19 质粒。本实验成功地将 EGⅢ基因构建至了 pYES2 上并通过醋酸锂转化法得到了酵母转化子。本文对酵母转化子进行了 DNA 水平、RNA 水平和蛋白水平三个层次的检测。酵母转化子的菌落 PCR 和 质粒的限制性内切酶双酶切均验证了 pYES2-EGⅢ重组质粒转入了酿酒酵母 中；Northern 杂交显示带有 EGⅢ的酵母转化子在诱导培养下 EGⅢ基因成功转 录；刚果红染色显示，转化子可产生明显的水解圈，说明 EGⅢ的自身信号肽 能被酿酒酵母所识别，其蛋白能够分泌至胞外；CMC 酶活检测显示该基因能 在酿酒酵母中表达有生物活性的 EGⅢ蛋白，经发酵培养发现酶活在培养 60h 达到最高 0.041U/mL。 关键词 绿色木霉；葡聚糖内切酶Ⅲ；酿酒酵母；诱导表达 - - II - Abstract To study the construction of yeast bioengineering strain which can direct bioconversion of lifnocellulose to ethanol, the endo-β-glucanase Ⅲ（EGⅢ） cDNA gene of Trichoderma viride AS3.3711 was cloned with the RT-PCR protocol and constructed on the cloning vector pMD18-T. Then it was transformed into the DH5α. At the same time we compared transformation efficiency of three E.coli competent cell DH5 α ,BL21 and M15. After sequencing the EGⅢ gene was constructed on the S. cerevisiae induceable expression vector pYES2 and transformed into the H158