嵌合egfrvⅲscfv-cd137-cd3ζ质粒的构建及其所修饰t淋巴细胞的选择性杀伤作用-construction of chimeric egfr ⅲ scfv - cd 137 - cd3zeta plasmid and its selective killing effect on modified t lymphocytes.docxVIP

摘 要 背 景：以免疫效应细胞为基础的过继免疫治疗（AIT）是肿瘤生物治疗的重要方 法之一，从实验室到临床都显现出了一定的抗肿瘤作用，日益受到人们的重视。然而 对于大多数肿瘤来说，AIT 并未取得满意的治疗效果，在临床上只起辅助治疗作用。 嵌合抗原受体（CAR）基因修饰 T 细胞是近年来发展的靶向免疫治疗新策略，它赋予 T 细胞更强的增殖性，持久的生命力，靶向杀伤活性，使 T 细胞能克服肿瘤局部免疫 抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态，为肿瘤过继免疫治疗注入了新的活力。 表皮生长因子受体 III 型突变体（EGFRvIII）是脑胶质瘤等恶性肿瘤中表达率很高 的肿瘤特异性抗原，与肿瘤的发生、发展有密切关系，为肿瘤靶向治疗理想的分子靶 点。本课题设计第二代嵌合抗原受体 EGFRvIII scFv-CD137-CD3ζ，利用 EGFRvIII scFv 实现肿瘤抗原靶向性，共刺激分子 CD137 增强 T 细胞活性，CD3ζ 激活 T 细胞毒性反 应。以慢病毒介导 CAR 修饰 T 细胞，重定向 T 细胞特异性识别表达 EGFRvIII 的脑胶 质瘤细胞，体内外试验证实其选择性杀伤作用，为胶质瘤等恶性肿瘤的免疫治疗探索 新方法。 目 的：探讨嵌合EGFRvIII scFv-CD137-CD3ζ修饰T细胞对EGFRvIII阳性胶质瘤细 胞的靶向杀伤作用。 方 法：利用基因合成方法获得 Hinge-TM-CD137-CD3ζ，应用分子克隆技术将其 克隆入慢病毒转移载体 pCDH-CMV-MCS 的 EcoRI 和 BamHI 位点，新获得的载体命 名 pCDH-CD137-CD3ζ。用 PCR 扩增 pCR2.1TOPO-EGFRvIII scFv 中的 EGFRvIII scFv 基因序列，将其克隆入 pCDH-CD137-CD3ζ 的 EcoRI 位点，基因连接方向的确定用菌 落 PCR 鉴定。最后经 DNA 测序鉴定，新质粒命名为 pCDH-CAR。通过磷酸钙沉淀法 将包装质粒 pDel8.9、包膜蛋白质粒 pVSVG 和含目的基因的转移质粒 pCDH-CAR 共 转染 293T 包装细胞，收集病毒上清。用蔗糖超速离心沉淀法浓缩，制备成慢病毒 （LV-EGFRvIII/CAR），用 p24 ELISA 试剂盒测定病毒滴度。应用免疫磁珠技术分离、 激活人外周血 CD3+T 淋巴细胞并用慢病毒感染，用流式细胞仪和 Western blot 检测 CAR 在 T 细胞的表达，51Cr 释放法检测 CAR+T 细胞的选择性杀伤作用，ELISA 法检 测细胞因子 IFN-γ 的分泌。并在裸鼠体内验证其对人脑胶质瘤细胞株 EGFRvIII+U87 的肿瘤抑制作用。 I PAGE PAGE VI III III 结 果：DNA 测序鉴定嵌合抗原受体各基因片段 EGFRvIII scFv、铰链区、跨膜区、 CD137 胞内段和 CD3ζ 序列和连接正确，制备的慢病毒 LV-EGFRvIII/CAR 滴度达 1.8x106TU/ml，转染 T 细胞的效率 68.73%，体外试验显示 CAR+T 细胞对 EGFRvIII+U87 胶质瘤细胞的抗原依赖性激活和特异性的杀伤作用，共培养上清中检测到显著的 IFN-γ 活性，动物实验显示出 CAR+T 细胞对裸鼠移植肿瘤的特异性肿瘤抑制作用。 结 论：CAR+T 细胞在体内和体外均显示出较好的肿瘤抗原特异性杀伤作用，为 靶向性肿瘤过继免疫治疗奠定了一定的实验基础。 关键词：过继免疫治疗，嵌合抗原受体，T淋巴细胞，EGFRvIII，慢病毒 ABSTRACT Backgroud Based on immune effector cells, adoptive immunotherapy is one of the important methods of tumor biological treatment, which showed a certain amount of anti-tumor effect from the laboratory to the clinic. More and more people pay attention to it. However, for most of the tumor, AIT did not show the satisfactory curative effect. It only played the auxiliary therapeutic action in clinic. T cell which is genetically modified with chimeric antigen receptor is a new targ