葡萄金黄化植原体基因芯片检测技术及rflp分析的分析-analysis of gene chip detection technology and rflp analysis of golden grape explant.docxVIP

葡萄金黄化植原体基因芯片检测技术及RFLP分析的研究摘要本研究通过对植原体15个组主要代表种的16SrDNA序列比对分析，设计植原体基因芯片引物及探针，以期为葡萄金黄化植原体（Flavescencedorée，FD）的检测及植原体各亚型的鉴定提供一种快速、灵敏、高通量的检测途径。研究所设计的芯片引物扩增植原体得到的片段大小（约290bp）均与预期结果一致，说明所建立的荧光标记PCR反应体系正常；探针特异性检测试验表明：植原体属探针（Phy探针）只有在检测植原体时才出现阳性信号，FD探针只有在检测16SrV植原体时才出现阳性信号，PaWB探针只有在检测泡桐丛枝病（PaWB）植原体时才出现阳性信号，说明所设计的探针特异性强；灵敏度检测试验表明：利用FD基因扩增产物构建质粒检测基因芯片的检测灵敏度达模板量103拷贝/?L，灵敏度要高于普通PCR，且通过检测结果可直接对不同植原体种做出准确鉴定，还具有可同时检测多种样品中不同病原的特点；芯片稳定性验证结果表明：本研究所设计的芯片重复性好、稳定性强，相同杂交条件下，批次内和批次间的基因芯片都可检测到明显的杂交信号，但不同批次及批次间的芯片检测信号存在一定差异，只可做定性判定；对芯片的最佳杂交时间、杂交温度、杂交液成分设不同梯度进行优化，确定杂交温度45℃，杂交时间1h，杂交液2.5%甲酰胺，0.2%SDS，6×SSC为最佳杂交体系。最终成功构建了FD基因芯片检测体系。采用植原体通用引物R16mF2/R16mR1对16SrV植原体进行扩增，成功构建重组质粒，并序列测定，测定结果与GenBank公布序列一致。用XmnI、XspI、TaqI和RsaI4种限制性内切酶对所扩增的16SrV植原体16SrDNA进行酶切，琼脂糖凝胶电泳，结果表明：除葡萄金黄化C型（FD-C）和悬钩子矮化（RUS）植原体之间没有出现可相互区分的特异性条带外，其它各植原体之间都可以通过特异性条带的比较进行区分；TaqI和RsaI两种限制性内切酶分别对16SrV-D和16SrV-B亚组的植原体特异。对新疆主要葡萄种植区进行葡萄黄化类植原体病害调查，将疑似症状的植株进行PCR检测和芯片检测，检测结果表明：新疆地区尚未发现葡萄黄化植原体病害；新疆阿克苏地区枣园中发现枣疯病（JWB）植原体，该植原体与FD属于同一组（16SrV）。目前新疆还没有此类病害的发生，但属于该病发生的适生区，因此有必要加强对本地区葡萄黄化类植原体病的检测和预防工作。关键词：葡萄金黄化植原体；基因芯片；PCR；限制性片段长度多态性InvestigationonDNAmicroarraytechnologyfortheDetectionandRFLPAnalysisofFlavescencedoréePhytoplasmaAbstract16SrDNAsequenceofmajorrepresentativespeciesofphytoplasma15groupswereanalysed,andprimersandprobesofDNAmicroarrayweredesignedinthisstudy,expectedthatafast,sensitiveandhigh-throughputapproachforthedetectionofFlavescencedorée(FD)phytoplasmawasprovided.Thefragment(about290bp)wasamplifiedfromphytoplasmawithDNAmicroarrayprimers,whichwasconsistentwithexpectantsize,theresultsshowedthatthereactionsystemoffluorescentmarkerPCRwasnormal;thespecificexperimentsofprobesshowedthat:Phyprobeappearedpositivesignalswhendetectingonlyphytoplasma,FDprobeappearedpositivesignalswhendetectingonly16SrVgroupphytoplasma,PaWBprobeappearedpositivesignalswhendetectingonlyPaulowniawitchesphytoplasma,theresultsshowthatthedesignedprobesweredifferential;thesensitivityexperimentsshowedthat:theminimumtargetconcentrationsthatcouldbedetectedwere103copies/