犬副流感病毒的检测和np基因的克隆 表达及其重组蛋白的免疫学活性的分析-detection of canine parainfluenza virus, cloning and expression of np gene and analysis of immunological activity of recombinant protein.docxVIP

I I 犬副流感病毒的检测和 NP 基因的克隆、表达及其重组蛋白的免 疫学活性的研究 摘要 犬传染性呼吸系统疾病（Canine Infectious Respiratory Disease，CIRD）即犬窝咳，临床特征表 现为发热、咳嗽、流涕，是一种多因素和多病原引起的犬的重要疾病，其中犬副流感病毒（Canine Parainfluenza Virus，CPIV）是 CIRD 的主要病原。犬副流感病毒属副黏病毒，是不分节段的 RNA 病 毒，其基因全长为 15246nt，主要由 NP 基因、P 基因、M 基因、F 基因、HN 基因、L 基因组成。1967 年 Binn 等人首次用犬肾细胞（MDCK）从具有呼吸道症状的病犬中分离得到 CPIV。血清学调查表 明 CPIV 在世界各国普遍存在，是危害犬业重要传染病之一。 本研究工作主要分三个部分来进行： 1．本研究首先通过建立犬副流感病毒 RT-PCR 检测方法，用于检测 CPIV。经特异性试验、敏 感性试验和重复性试验表明建立的 RT-PCR 方法是一种比较良好的检测 CPIV 的方法。采用此方法对 临床收集的 32 份样品进行检测，阳性率为 53.12％。 2．克隆的犬副流感病毒 NP 基因全长为 1658bp。首先从病犬的鼻腔分泌液中提取总 RNA，然 后用 RT-PCR 扩增得到目的基因，将其克隆到 PMD18-T simple vector 中，测序检验。结果表明获取 的 NP 基因核苷酸序列与 GeneBank 中标准序列存在三处碱基变异，导致编码的蛋白质出现三个氨基 酸的变异。 3．用 PCR 技术以 NP 蛋白全基因质粒为模板扩增出 NP 蛋白的表达基因序列 1530bp，然后将 其定向插入到 PGEX-6P-1 中，构建其原核表达载体 PGEX-6P-1-NP，并且在大肠杆菌 BL21（DE3） 中成功表达，经 Wester-blot 分析结果表明重组融合蛋白（GST -NP）蛋白具有一定的免疫学活性。 关键词：犬副流感病毒；RT-PCR；克隆；NP 蛋白；原核表达；免疫学活性 II II Detection of Canine Parainfluenza Virus and Study on Cloning and Expression of CPIV-NP Gene and Immunocompetence of Its Recombinant Protein Abstract Canine infectious respiratory disease(CIRD)in dogs,referred to respiratory illness kennel cough.The main clinical symptoms of including fever,cough and nose running,which were caused by such as multiplex,pathogens,virus and bacterium,and canine parainluenza virus(CPIV) was main cause of CIRD.CPIV was a single-strand negative RNA virus which belongs to the paramyxoviridae family.The total genome of CPIV is approximately 15245nt,which contain NP, P, M, F, HN and L genes.Binn and his colleges first isolated a strain of CPIV from sick dogs with respiratory syndrone using Madine-Darby Canine kidney (MDCK) cells in 1967.The investigation indicate CPIV was one of the main infectious disease in dogs. So three study were conducted to research CPIV in the present article as followings: 1 ． A RT-PCR method was developed to detect of CPIV.The result of specific,sensitive and reproducibility tests was shown that established RT-PCR method was a good method fo