融合基因rgd3-dab391原核表达载体构建及表达与体外肿瘤抑制效应探讨-construction and expression of fusion gene rgd 3 - dab 391 prokaryotic expression vector and study on its tumor inhibitory effect in vitro.docxVIP

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2018-07-29 发布于上海
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融合基因rgd3-dab391原核表达载体构建及表达与体外肿瘤抑制效应探讨-construction and expression of fusion gene rgd 3 - dab 391 prokaryotic expression vector and study on its tumor inhibitory effect in vitro.docx

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融合基因rgd3-dab391原核表达载体构建及表达与体外肿瘤抑制效应探讨-construction and expression of fusion gene rgd 3 - dab 391 prokaryotic expression vector and study on its tumor inhibitory effect in vitro

技术路线和实验流程包含白喉序列的质粒PCR包含RGD序列的引物(RGD)3-DAB391pGEM-重组克隆载体Teasyvector(RGD)3-DAB391/T载体NdeⅠ+XhoⅠ酶切pGEM-Teasyvector(RGD)3-DAB391pET-28a(+)重组表达载体vectorIPTG诱导蛋白表达Ni-NTAHis·Bind层析纯化目的蛋白原核表达系统(RGD)3-DAB391/pET-28a还原/氧化谷胱甘肽复性目的蛋白体外验证（MCF-7+MDA-MB-231）增殖（MTT）凋亡（流式细胞术）摘要【目的】本研究主要探讨RGD肽与受体区缺失的白喉毒素前391个氨基酸(DAB391)通过基因重组的方法所构建的融合基因表达与效应验证以及和环状RGD肽之间的功能比较。通过对乳腺癌细胞株MCF-7及MDA-MB-231增殖及凋亡过程的影响，探讨其在靶向性肿瘤治疗中的作用机制。【方法】通过基因重组的方法构建特异性靶向分子(RGD-RGD-RGD)-DAB391（以下简写为(RGD)3-DAB391）的原核表达载体以及不含RGD序列的DAB391原核表达载体，选择性的诱导其蛋白的表达，以Ni2+-NTA亲和层析的方法对表达的蛋白进行纯化，纯化后的蛋白复性后通过体外细胞学检测其功能。以MTT法比较不同分子对肿瘤细胞的增殖抑制效应，通过流式细胞学技术检测其对肿瘤细胞的凋亡诱导作用差异。【结果】成功构建了重组的原核表达载体(RGD)3-DAB391/pET-28a，经过IPTG诱导后可表达相对分子量约为45000的目的蛋白，其产量约占大肠杆菌总蛋白的25%。将表达产物经过变性、纯化之后可以得到约为90%纯度的(RGD)3-DAB391融合蛋白。采用还原/氧化体系复性的方法，最终获得了一定数量的有活性蛋白：(RGD)3-DAB391。同样也得到了部分有活性的DAB391蛋白。重组的(RGD)3-DAB391融合蛋白及RGD肽均对肿瘤细胞具有一定的增殖抑制作用，且融合蛋白的作用更强（P＜0.01）；上述两种分子均可增加肿瘤细胞的凋亡，且融合蛋白的效应更明显（P＜0.01）。复性后的DAB391蛋白则对上述两种肿瘤细胞无明显作用（P＞0.05）【结论】成功构建并获得有活性的(RGD)3-DAB391融合蛋白，其显示出了强于RGD肽的肿瘤杀伤效应，为进一步研究小分子导向肽在恶性肿瘤的靶向治疗应用方面提供了新的思路。【关键词】(RGD)3-DAB391融合蛋白；RGD肽；MCF-7细胞；MDA-MB-231细胞Constructionandexpressionoffusiongene(RGD)3-DAB391prokaryoticexpressionvectorandstudyofitstumordepressioneffectinvitroAbstractObjective:ThisstudyinvestigatedtheexpressionofconstructedrecombinantfusiongeneoftheRGDpeptidelinkingtheabsenceofthediphtheriatoxinreceptorareabeforethe391aminoacids(DAB391)anditseffectvalidationcomparedwiththecyclicRGDpeptide.Toinvestigatethoseinfluenceonproliferationandapoptosisofbreastcancercelllines:MCF-7andMDA-MB-231invitroanddiscussthemechanismintumourtargetedtherapy.Methods:Toconstructspecifictargetingmolecules(RGD-RGD-RGD)-DAB391(Thefollowingabbreviatedas(RGD)3-DAB391)prokaryoticexpressionvectorandthenon-RGDsequenceoftheprokaryoticexpressionvectorDAB391byrecombinantmethod.ToinducetheexpressionofthoseproteinsSelectivelyandpurifytheexpressedproteinsbyNi2+-NTAmetalaffinitychromatography,thentestthosecytologyfunctionsafterPurifiedproteinrefoldinginvitro.CellproliferationwasevaluatedbyMTTassay.