人胎肝细胞系l-02的功能检测和应用探讨-functional detection and application of human fetal hepatocyte line l - 02.docxVIP

全文缩略词对照表AbbreviationIndex英文缩写英文全称中文全称LTxLivertransplantation肝移植HTHepatocytetransplantation肝细胞移植BALBioartificialliver生物人工肝ALFAcuteliverfailure急性肝衰竭HEHepaticencephalopathy肝性脑病BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液DAPI4,6-diamidino-2-phenylindole4,6-二脒基-2-苯基吲哚PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RT-PCRReversetranscriptionPCR逆转录PCRIFImmunofluorescence免疫荧光FITCFluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素TRITCtetramethylrhodamineisothiocyanate四甲基异硫氰酸罗丹明NCSNewborncalfserum新生牛血清FBSFetalbovineserum胎牛血清ALBalbumin白蛋白UGTUDP-glucuronosyltransferase尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶HBCFHumanbloodcoagulationfactor人凝血因子bpBasepair碱基对独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密□，在年解密后适用本授权书。不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日前言急性肝衰竭(Acuteliverfailure,ALF)死亡率很高,目前可根治急性肝衰竭的唯一方法是肝移植。但供肝数量远远不能满足患者的需求，很多急性肝衰竭患者在等待肝移植的过程中死亡。除肝移植外，急性肝衰竭尚有两种有效治疗方法，即肝细胞移植和生物人工肝。作为急性肝衰竭病人接受肝移植前的一种过渡性治疗措施，肝细胞移植和生物人工肝都需要大量的肝细胞，但目前人原代肝细胞的来源很困难，主要是可供分离肝细胞的肝脏来源不足，且原代肝细胞体外培养增殖极为困难。其他的一些可用细胞系，如干细胞、永生化肝细胞、异种肝细胞等，都有或多或少的不足，如永生化肝细胞潜在的致瘤危险性，异种肝细胞强烈的排异反应，有关干细胞的研究尚不充分等。人胚胎肝细胞作为肝细胞移植和生物人工肝一种可用的细胞来源，已有相关研究证实了原代分离的胚胎肝细胞具有成人肝细胞类似的肝细胞功能。人胚胎肝细胞系L-02，是上世纪80年代由国内学者自行建系的胚胎肝细胞系，其体外培养容易，来源方便，目前多作为许多实验的对照组正常肝细胞。但L-02细胞系是否具有肝细胞相关功能及是否能应用于肝细胞移植和生物人工肝，目前国内外文献中尚无报道。本实验的基本思路即验证L-02肝细胞作为胚胎肝细胞体外培养增殖后是否仍然具有正常成人原代肝细胞类似的肝细胞功能，及将L-02细胞应用于肝细胞移植是否具有治疗急性肝衰竭的效果，以期为肝细胞移植和生物人工肝，或新药的开发、病毒性肝炎的研究模型提供一种新型可用的肝细胞系。材料与方法实验材料：一、主要实验仪器：HERACELL240i二氧化碳培养箱美国Thermo公司光学倒置显微镜日本Olympus公司医用超净工作台苏州净化设备公司-80℃超低温冰箱美国Thermo公司台式高速离心机德国Eppendorf公司低温离心机德国Eppendorf公司超滤水净化系统美国LABCONCO公司多功能酶标仪美国BioTek公司UVP凝胶成像分析系统美国Bio-Rad公司WesternBlot及PCR电泳仪美国Bio-Rad公司全自动PCR仪美国Bio-Rad公司微量移液器德国Eppendorf公司电子天平METTLERTOLEDO有限公司激光共聚焦显微镜日本Olympus公司二、主要实验试剂：DMEM高糖培养基美国GIBCO公司特优级胎牛血清美国GIBCO公司新生牛血清美国GIBCO公司胰蛋白酶