人bmi1基因真核表达载体的构建 鉴定及其对乳腺癌mdamb468细胞的效应-construction and identification of eukaryotic expression vector of human bmi 1 gene and its effect on breast cancer md amb 468 cells.docxVIP

11喇Tl喇?J喇5J811121/1111原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在辱师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体巳经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者:日期:年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，问意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅:本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部成部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制于段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者:日期:年月摘要摘要背景和目的乳腺癌是严重危害妇女健康的一种疾病。Bmi1基因(B-cellspecificmoloneyleukemiavirusinsertsite1，Bmi-1)是PcG(polycombgroupgenes)家族熏耍的调节基因，位于人类10号染色体规臂1区3带(10pI3)，在调节细胞周期及增殖方面具有重要作用。研究发现，Bml基因在乳腺癌及乳腺癌细胞系中高表达，与乳腺癌的发生发展密切相关，但其作用机制仍不清楚。研究显示，在人正常鼻咽上皮细胞中过表达Bmi-l基因后，能够激活hTERT的转录，诱导端粒酶活性并维持端粒在一定的长度，并且能够下调p16INK铀的表达，影响细胞周期及增殖，促使人正常鼻咽上皮永生化。此外，Bmi寸基因可以维持胚胎干细胞和肿瘤干细胞的自我更新及增殖活性，目前已有研究证明，在人神经胶质瘤U87细胞中，过表达Bmil基因后，能够上调Oct吨的表达，提示Bmi-l基因可能在干细胞水平参与了神经胶质瘤的发生与发展。在以往研究的基础上，本研究构建人Bmi寸基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)…Bmi寸。转染人乳腺癌MDAMB币468细胞48h后，RTPCR鉴定目的基因Bmi一1的mRNA表达变化，以G418进行筛选，建立了pcDNA3.1(+)-Bmi才真核表达载体稳定转染的乳腺癌细胞系。应用免疫细胞化学方法验证Bmi-l基因蛋白水平上的表达变化。应用RTPCR的方法检测Bmi寸基因mRNA水平上的表达变化。通过MTT技术检测pcDNA3.1(+)-Bmi才表达载体对MDA四MB-468细胞的影响，为进…步深入探讨Bmi一l基因在乳腺癌中发生作用的分子机制提供实验基础。材料与方法1.主要材料z人乳腺癌MDAMB468细胞由郑州大学中英医学实验蜜馈赠:真核表达载体pcDNA3.1(+)由郑州大学生化教研室贼明经教授及郑州大学组胚教研室杨继要老师惠赠。2.构建pcDNA3.1(+)…Bmi才真核表达载体:采用半定量RTPCR的方法检测乳腺癌MDA-MB-468细胞及MCF7细胞中BmilmRNA的表达。从MCF-7细胞中提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，PCR扩增加l1cDNA全长。将Bmi一1基因片段经摘要T-A克降后亚克降至真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建成人Bmi寸基因的真核表达载体pcDNA3.1(吟唱mi寸，酶切、电泳及测序鉴定。3.细胞培养及转染:乳腺癌MCF-7细胞培养于含有100FBS的RPMI1640培养基中，37.C，5%C02培养箱中贴壁培养;乳腺癌MDA-MB468细胞于含有10%FBS的DMEM高糖培养基中，370，5%C0培养箱中贴壁培养。转染MDA-MB468细胞C2叩前，更换新鲜培养基。采用高纯度中最质粒提取试剂盒抽提pcDNA3.1(+)与?pcDNA3.1(+)甲Bmi10MDAMB468细胞随机分为建组质粒转染组，空载体组和空白对照组，用Lipofecter脂质体转染试剂将pcDNA3.1(t)Bmi-l导入重组载体转染组，将pcDNA3.1(t)导入空载体组，空白对照组未转染质性。4.筛选与扩增z转染后的细胞铺满培养板后，按1:4的密度比传代至新的培养板。于含有lmg/mlG418的DMEM商糖选择性培养基中筛选，每3d更换一次培养基，至第7天，空白对照组细胞死亡，改用400μg/ml的选择性培养基继续筛选，约2w后，阳性细胞克隆形成，将单克降细胞挑入24孔板，继续培养。细胞铺满培养板后，移入培养瓶扩大培养。5.pcDNA3.1(吟唱mi-l表达载体对乳腺癌MDA…刷一468细胞的效应:应用免疫细胞化学检测Bmi叩1、hTERT、p16INK4a及Oct4蛋白表达水平的变化:应用RT-PCR检测Bmi-寸及hTERT的mRNA表达水平变化: