人grp78 mirna载体的构建及其对ec109细胞增殖的影响-construction of human grp 78 mirna vector and its effect on proliferation of ec 109 cells.docxVIP

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2018-07-29 发布于上海
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人grp78 mirna载体的构建及其对ec109细胞增殖的影响-construction of human grp 78 mirna vector and its effect on proliferation of ec 109 cells

中文摘要研究目的:构建人GRP78miRNA表达载体，筛选出最佳干扰效果的干扰载体，转染EC109细胞，探讨其对EC109细胞增殖的影响。材料和方法：1、根据miRNA干扰原理，设计合成4对针对人GRP78的特异性miRNA干扰序列，连接到pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR表达载体，分别命名为miR78-1、miR78-2、miR78-3、miR78-4，并通过测序鉴定。2、把测序正确的干扰质粒利用脂质体Lipofectamine2000转染HEK293细胞，荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况以检测转染效率，通过杀稻瘟菌素筛选2周左右，得到稳定表达干扰质粒的细胞株，通过RT-PCR检测稳定筛选后HEK293细胞中GRP78mRNA的表达水平。3、将最佳干扰效果的干扰质粒瞬时转染EC109细胞，通过RT-PCR检测转染24h后GRP78mRNA的表达水平，利用CCK8检测转染干扰质粒0h、12h、24h、48h、72h后EC109细胞的增殖情况。结果：1、DNA测序表明重组质粒中含有目的片段，且插入片段的碱基序列完整，没有碱基的突变以及丢失。2、建立了稳定表达干扰质粒的HEK293细胞株，稳定转染后HEK293细胞在荧光显微镜下观察均有绿色荧光蛋白表达。与阴性对照组、未转染组比较，在干扰组细胞中GRP78mRNA的表达有不同程度的下降(P0.05)，其中转染miR78-1组GRP78mRNA的表达下降最明显(P0.05)。3、miR78-1干扰质粒瞬时转染EC109细胞后，与未转染组、阴性对照组相比，细胞中GRP78mRNA的表达下降(P0.05)；CCK8检测结果表明转染miR78-1干扰质粒12,24,48,72h后，EC109细胞的增殖减慢(P0.05)。结论：1、设计的4对干扰序列正确完整地克隆到miRNA表达载体pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR中，GRP78miRNA表达载体构建成功。2、成功建立了GRP78基因“敲弱”的HEK293细胞模型，筛选出miR78-1为最佳干扰效果的干扰载体。3、miR78-1干扰质粒瞬时转染EC109细胞后，能抑制EC109细胞中GRP78mRNA的表达，能抑制EC109细胞的生长。关键词：GRP78；miRNA；EC109细胞，HEK293细胞；细胞增殖AbstractObjective:ToconstructaneffectivemiRNAexpressionvectorofhumanGRP78geneandtoobserveitseffectonproliferationofEC109cells.MaterialsAndMethods：FouroligonucleotidesofhumanGRP78wereclonedintopcDNA?6.2-GW/EmGFP-miRexpressionvector,whichwasnamedmiR78-1,miR78-2,miR78-3,miR78-4respectively.Thefourrecombiantvectorswereidentifiedbysequencing.ThefourrecombiantvectorsandanegativecontrolvectorweretransfectedintoHEK293cellsusingLipofectamine2000.Thegreenfluoresentproteins(EGFP)weremeasuredbyfluoresencemicroscopyincellstoobservetransfectionefficiency.Aftertreatmentwithblasticidinintwoweeks,thestabletransfectantscellswithGRP78-miRNAwereobtained.ReversetranscriptionalPCR(RT-PCR)wasperformedtoevaluatetheeffectsofgenesilencing.Thebestinterferentialplasmid(GRP78miRNA)wasselectedandtransfectedintoEC109cells.24haftertransfection,expressionsofGRP78mRNAweredetectedbyRT-PCR.TheproliferationofEC109cellswasdeterminedbyCCK-8assayin0,12,24,48,72haftertransfection.Results:Allrecombiantvectorsweresuccessfullyconstructedbysequencingan