任务单元抗原抗体的制备ppt课件.pptVIP

任务六 抗原抗体的制备;主要内容;学习目标;单元一 抗原的制备;一、颗粒性抗原的制备;采集静脉血;(二)细菌抗原的制备;1.制备方法;2.细菌抗原的检定;二、可溶性抗原的制备;二、可溶性抗原的制备;（一）材料的选取与预处理;二、细胞裂解;;;2.超声波破碎法;3.酶处理法;4.反复冻融法;5.表面活性剂处理法;;（三）可溶性抗原纯化;（1）超速离心法;（2）选择性沉淀法;（3）凝胶过滤法;（4）离子交换层析法;（5）亲和层析法;2.核酸抗原的制备;核酸的保存 （1）温度 -70℃ 长期保存 -20℃ 4℃（5℃）最佳和最简单 （2）介质 TE缓冲液（最常用）;3.脂多糖抗原的制备;4.Ig片段的制备;（2）共价键解离法 二硫键是连接免疫球蛋白肽链的共价键，解离二硫键可将轻链与重链分开。解离的方法多采用氧化法和还原法。氧化法的优点是切开二硫键后，肽链不能重新形成二硫键，便于肽链纯化，缺点是蛋氨酸(甲硫氨酸)被氧化成亚砜，色氨酸侧链被破坏。 还原法目前常用，其原理是将二硫键还原成巯基，但还原的琉基极不稳定，易再重新结合成二硫键，必须及时用碘乙酸或碘代乙酰胺进行羧甲基化以封闭巯基。;（3）酶解法 酶解法的专一性极好，不同的片段可用不同的酶进行裂解。如木瓜酶水解IgG可获得1个Fc段和2个Fab段；胃蛋白酶水解IgG可获得F(ab)：和数个小片段。用木瓜酶水解得到的Fc段常作为抗原来制备抗重链血清，胃蛋白酶水解得到的F(ab)；常作为抗体试剂应用。;（四）纯化抗原的鉴定、浓缩与保存;三、半抗原的制备; 2.多肽聚合物 人工合成的载体。常用多聚赖氨酸(polylysine)，其分子量高达lOOkD以上，是良好的载体。这种多肽聚合物与半抗原结合后，可诱导产生高效价、高亲合力的抗体。 3.大分子聚合物 羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidonc，PVP)等大分子聚合物均可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。 ;（二）半抗原与载体的连接方法 1.物理法 通过吸附作用。 2.化学法 通过交联实现。 （三）半抗原的鉴定 1.目的：测定半抗原与载体的比例。 2.测定方法： （1）吸收光谱分析法 （2）放射性核素标记半抗原掺入法 ;（1）如果半抗原有适宜的吸收光谱，测定在一定波长下复合抗原和载体之间克分子吸光度的差别，然后把这个差别与同样波长下半抗原的克分子吸光度数相比较，就可以准确地计算出所结合的半抗原分子数。 （2）在偶联反应液中加入一定量的放射性核素标记的半抗原，偶联反应后经充分透析，测量透析袋中的放射性含量，计算结合到载体上的半抗原分子数。;四、免疫佐剂;（一）佐剂的种类与制备;具备免疫原性的佐剂：如卡介苗、枯草分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、脂多糖、细胞因子等。 不具备免疫原性的佐剂：如氢氧化铝佐剂、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、多聚核苷酸、胞壁肽等。 应用最多的是福氏佐剂、细胞因子佐剂。 ;（1）福氏佐剂：分完全福氏佐剂（石蜡油+羊毛脂+卡介苗）、不完全福氏佐剂（石蜡油+羊毛脂）两种。福氏完全佐剂可提高佐剂效能，但注射后易产生局部持久性溃疡和肉芽肿，宜注意。 （2）细胞因子佐剂：细胞因子佐剂与抗原合用，可有效激发机体的免疫功能。IL-2、IL-1、IFNγ、IL-12、GM-CSF皆较常应用；细胞因子佐剂还被广泛应用于肿瘤基因治疗中。 ;用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、poly I∶C、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白 常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freund’s adjuvant) 。 ;2.制备 ;制备方法 （1）研磨法 （2）搅拌混合法（注射器混合法） （3）其他方法 超声;（二）佐剂的作用机制;（三）佐剂的应用原则;小结;