驱动蛋白kif1a中cc1-fha结构域的结构及功能研究-structure and function of cc1 - fha domain in kif1a.docx

万方数据 万方数据 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密□，在年解密后适用本授权书。 本论文属于  不保密□√。 (请在以上方框内打“√”) 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 摘 要* 驱动蛋白 Kinesin-3 家族在神经细胞的突触囊泡和膜结合细胞器的运输中起着重 要作用。当没有绑定 cargo 的时候，驱动蛋白自身会抑制 ATP 的水解使其处于失活 的状态，从而不能行使运输的功能。关于解释驱动蛋白不装载 cargo 的时候如何处于 一个受抑制的状态，有两种模型被提出。第一种模型认为，二聚体的驱动蛋白受自 我抑制机制调控。第二种模型认为，驱动蛋白通过单体到二聚体的构象变化来进行 活性的调节。目前的证据表明，驱动蛋白 Kinesin-3 家族的成员 KIF1A 在体外以单体 的形式存在，在体内以二聚体的形式存在。 我们已知 KIF1A 在体内处于一个二聚的非活性状态，且其活性受到自我抑制机 制的调控。在本文中，我们进一步证明 KIF1A 中 CC1-FHA 片段以稳定的二聚体形 式存在。通过解析 KIF1A 中间调节片段 CC1-FHA 的晶体结构，我们发现在 CC1 和 FHA 的交界面存在一个 β-finger 的发卡结构能够使 CC1-FHA 形成一个同源二聚体。 更重要的是，解离 CC1-FHA 二聚体能够释放 CC1 和 β-finger，而 CC1 和 β-finger 能 够直接抑制驱动蛋白的活性。因此，CC1-FHA 的二聚化不但能够促进 KIF1A 二聚体 的形成，同时能够通过抑制 CC1 和 β-finger 两部分来激活 KIF1A 马达的活性。我们 认为 CC1-FHA 结构域可能是控制 KIF1A 二聚化和活性的调节中心，且这种 CC1-FHA 区域介导的调节方式可能也适用于其他的 Kinesin-3 家族的驱动蛋白。 然而，仍然不能确定 CC1-FHA 二聚体在体外的生化和结构特征是否对 KIF1A 介导的轴突上的 cargo 运输起着重要作用。我们以线虫作为模式生物研究 CC1-FHA 结构域对 KIF1A 介导的轴突运输的潜在功能。注射 KIF1A 以及去掉 β-finger 的质粒 (?[474-486]-KIF1A)都能够恢复 unc-104(e1265)突变体的运动缺陷。然而，注射解聚 CC1-FHA 后仍能暴露 CC1 和 β-finger 的质粒(L508Q/Y510Q-KIF1A)不能够恢复 unc-104(e1265)的运动缺陷，同时影响突触囊泡在轴突上的正常运输，使其在胞体中 堆积。结合上述体外实验的实验结果，体内实验更确切地证明了 CC1-FHA 结构域对 *本研究课题得到国家自然科学基金资助项目3119006231128010） 和国家重点基金研究发展计划（2010CB833701，2011CB910503）资助。 I II万方数据 II 万方数据 KIF1A 介导的轴突上的突触囊泡的运输起着重要的作用。 最近几年，单分子技术被频繁地应用到新的定量性和机理性的生物分子功能实验 中。然而，现行的活细胞单分子成像一般只用来观察细胞膜上的事件，分析细胞质 中的事件受到标记技术的制约。分析细胞质中的事件，需要荧光蛋白探针能够直接 跟踪细胞质中单个独立分子，而且要能够保持生物分子的功能，同时还要避免外部 吸收的干扰信号。在本文中，我们用 mEos3.2（一种光转化蛋白）标记 Kinesin-3 家 族的驱动蛋白，证明了这种荧光蛋白能够利用高的时间和空间分辨率来追踪活细胞 细胞质中的单分子运动。同时，我们提出假设，Kinesin-3 家族中的不同驱动蛋白的 运动速度主要是依靠催化结构域，即 motor domain 来调节。 关键词：Kinesin-3 KIF1A，轴突运输，秀丽线虫，突触囊泡，CC1-FHA，单