山克隆测序分析羊痘病毒基因组提取、酶切及tk基因-cloning and sequencing of goat pox virus genome extraction, enzyme digestion and tk gene analysis.docx

HYPERLINK \l _bookmark0 2.3 病毒基因组的酶切结果 17 HYPERLINK \l _bookmark1 3 讨论 19 HYPERLINK \l _bookmark2 第四章 山羊痘病毒 TK 基因克隆与测序分析20 HYPERLINK \l _bookmark2 1 材料与方法 20 HYPERLINK \l _bookmark2 1.1 材料 20 HYPERLINK \l _bookmark2 1.2 方法 20 HYPERLINK \l _bookmark3 2 结果与分析 21 HYPERLINK \l _bookmark3 2.1 TK 基因的 PCR 扩增 21 HYPERLINK \l _bookmark4 2.2 TK 基因的克隆与重组克隆的筛选及鉴定 22 HYPERLINK \l _bookmark4 2.3 TK 基因的序列分析 22 HYPERLINK \l _bookmark5 3 讨论 24 HYPERLINK \l _bookmark6 结 语 26 HYPERLINK \l _bookmark7 山羊痘研究概况 27 HYPERLINK \l _bookmark7 1. 病原学 27 HYPERLINK \l _bookmark8 2. 羊痘病毒相关热点基因、蛋白的研究28 HYPERLINK \l _bookmark9 3. 流行病学 29 HYPERLINK \l _bookmark10 4. 临床症状 30 HYPERLINK \l _bookmark10 5. 发病机理 30 HYPERLINK \l _bookmark11 6. 病理变化 31 HYPERLINK \l _bookmark11 7. 诊断方法 31 HYPERLINK \l _bookmark12 8. 疫苗的研究及应用 34 HYPERLINK \l _bookmark13 9. 防制措施 35 HYPERLINK \l _bookmark14 主要参考文献 36 HYPERLINK \l _bookmark15 附录二 各种溶液、试剂及培养基的配制和主要仪器 41 HYPERLINK \l _bookmark16 附录三 发表文章情况 43 HYPERLINK \l _bookmark17 致 谢 44 HYPERLINK \l _bookmark18 原 创 性 声 明 45 II 1 1 山羊痘病毒基因组提取、酶切及 TK 基因克隆测序分析 摘 要 羊痘（山羊痘和绵羊痘）是由羊痘病毒属（Capripoxvirus）病毒引起的山羊及绵羊 的一种急性、热性、高度接触性传染病。本病在印度、孟加拉、中东以及非洲中北部地 区呈地方性流行，对养羊业造成严重的危害和巨大经济损失。被世界动物卫生组织（OIE） 列为 A 类传染病，在我国被列为一类传染病。本试验对山羊痘病毒荧光 PCR 检测方法 的建立、体外增殖规律、基因组酶切图谱差异及 TK 基因进行了相关研究。 1.山羊痘病毒 SYBR Green I 荧光 PCR 检测方法的建立 为建立山羊痘病毒（goat pox virus，GPV）的 SYBR Green I 模式荧光 PCR 方法，根据山羊痘病毒的反向末端重复序 列（Inverted Terminal Repeat，ITR）的核苷酸序列设计引物。以此引物和山羊痘皮肤痘 疹提取的 DNA 为模板，建立并优化 SYBR Green I 模式荧光 PCR 检测 山羊痘病毒的 ITR 基因的方法，并与普通 PCR 方法进行敏感性比较。结果表明：所建立的检测山羊痘 病毒的 SYBR Green I 模式荧光 PCR 方法能检测出 7×102 拷贝数的 DNA 模板，比文献 报道的普通 PCR 法更敏感、准确、快速。 2. 山羊痘病毒体外增殖规律初探 将山羊痘病毒标准弱毒株（B）和分离毒株（LD）接 种 Vero 细胞，感染细胞后每隔 12 h 观察细胞病变并收获细胞培养物，用已建立的 SYBR Green I 模式荧光 PCR 检测细胞培养物中山羊痘病毒含量并绘制生长曲线，可见：在 Vero 细胞中，二个毒株的增殖规律基本相似，山羊痘病毒各毒株在感染 12 h 时细胞培养物中 的病毒含量就开始增加，在 72 h～96 h 时 CPE 最为明显，Vero 细胞中的病毒含量也达 到最高。从而进一步了解了山羊痘病毒的增殖规律，山羊痘病毒在 Vero 细胞中的增殖 高峰期为 72 h～96 h，也是病毒收获的最佳时期，为疫苗的生产及后续试验提供了科学 依据