环境工程微生物学一微生物细胞数的计数.PPTVIP

环境工程微生物学实验实验六： 细菌的简单染色与革兰氏染色 适用范围：环境工程专业 实验教师：李宁 顾彦 一、目的 （1）了解细菌的涂片及染色在微生物学实验中的重要性。 （2）学会细菌染色的基本技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。 二、染色原理 由于微生物细胞含有大量水分，对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。 经测定，细菌等电点pH在2-5之间，故在中性、碱性或偏酸性溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的较多。微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。 (一)简单染色法 简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。 三、染色方法 (二)复染色法 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。 革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。 三、染色方法 三、染色方法 四、实验器材、试剂、材料 1. 材料： 枯草杆菌、大肠杆菌。 2. 器材： 废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜 3. 试剂： 草酸铵结晶紫染液 革兰氏碘液 体积分数为95%酒精 质量浓度为5g/L蕃红（沙黄）染色液 1．涂片 取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种(玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。 2．干燥（固定） 室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过2~3次，共约2~3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 五、实验内容与步骤 (一)细菌的简单染色 涂片→干燥（固定）→染色→水洗→干燥→镜检 3．染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 4．水洗 斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 5．干燥 用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥或微热烘干。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。 6．镜检 先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 (一)细菌的简单染色 涂片→干燥（固定） →染色→水洗→干燥→镜检 (二)细菌的革兰氏染色步骤 涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗→干燥→观察 五、实验内容与步骤 1. 涂片、固定 染色约1min同简单染色法。 2. 初染 滴加草酸铵结晶紫染色液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1-2min，水洗。 3. 媒染 滴加革兰氏碘液，染色约1-2min，水洗。 (二)细菌的革兰氏染色步骤 涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗→干燥→观察 4. 脱色 滴加体积分数为95%乙醇，约20-30S后即水洗，至流出的乙醇不现紫色为止；或滴加体积分数为95%乙醇后将玻片摇晃几下即倾去乙醇，如此重复2-3次后即水洗。 5. 复染 滴加沙黄染液（番红）1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约2-3min，水洗并使之干燥。 6. 镜检 同简单染色，并根据呈现的颜色判断该菌属是G+细菌还是G-细菌，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。 革兰氏染色 紫色的是革兰氏阳性菌， 红色的是革兰氏阴性菌。 六、注意事项 1．革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革