多重化学标记串联质谱技术在比较蛋白质组学中的应用ppt课件.pptVIP

; 研究不同生理和病理条件下细胞内蛋白质的含量和状态变化是比较蛋白质组学的核心内容要揭示上述动态过程往往需要进行多个样品的同步比较分析.近年来在体内和体外同位素标记基础上用多维液相色谱分离多肽，进而用串联质谱进行相对定量的分析方法已成为高通量比较蛋白质组研究的主要手段之一 ; 相对和绝对定量同位素标记( isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ ) 技术是美国应用生物系统公司在 2004 年推出的一项新的体外同位素标记技术.使用该技术可以寻找差异表达蛋白，并分析其蛋白功能，同时可以对1个基因组表达的全部蛋白质或1个复杂的混合体系中的所有蛋白质进行精确定量和鉴定.如今，iTRAQ 技术已经在蛋白质组学的定量研究中得到了极其广泛的应用 ; ;iTRAQ的8种同位素标记试剂由8种(或4种)相对分子质量均为305的等量异位标签分子组成 ; 报道基团(reporter group) 113 114 115 116 117 118 119 121 平衡基团(balance group) 192 191 190 189 188 187 186 184 1个相同的反应基团(reactive group ) ; 肽反应基团将iTRAQ标签与肽段的N-端基团和每个Lys侧链相连，可标记所有酶解肽段，在其上 8 种报告基团通过平衡基团与反应基团相连． 报告基团和平衡基团的平衡分子量都为305，因此改变任一iTRAQ试剂，不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测，分子量都完全相同.而在串联质谱中，同重元素标记肽段自所示虚线部分裂解，平衡基团在二级质谱发生中性丢失.信号离子表现为不同质荷比(113～121)的峰，因此，根据波峰的高度及面积，可以得到蛋白质的定量信息;; 生物质谱用于蛋白鉴定的基本原理; 二级质谱用于蛋白鉴定的基本原理; ; ; ; ; ; ; 4. 通过阳离子交换柱用的盐离子分离样品 ; 4. 通过阳离子交换柱用的盐离子分离样品 (1) 混合标记样品过柱子，使标记的肽端吸附于柱子上 （2）配置不同浓度的盐溶液洗脱液 20 30 40 50 60 70 80 90 100 125 150 175 200 350mM （3）浓度不同的洗脱液分别冲柱，收集不同的洗脱液，标清洗脱???浓度 （4）利用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干，用流动相A（通常是10μL， 98%水 2%乙腈 0.01%的TFA ）将肽端溶解 （5）上样点靶（含有基质和流动相），根据检测器的峰确定哪些点含有蛋白片段 （6）通常10μL样品混合基质和流动相会点半个板，约600个点 （7）风干 ; 4. 通过阳离子交换柱用的盐离子分离样品 ; 5. 质谱检测肽端的标签和含量差异 ; 5. 质谱检测肽端的标签和含量差异 ; ; iTRAQ 技术引入到抗菌肽的研究中．他们使用 iTRAQ 结合多维液相色谱和串联质谱联用技术,研究经最小抑菌浓度下的人源中性白细胞抗菌肽 HNP-1 处理后大肠杆菌的细胞变化．研究结果表明，一些参与糖酵解过程的蛋白酶含量丰度降低了.相反,许多蛋白如 AceE、AcnB 经 HNP-1 处理后含量丰度都显著提高了，而这些蛋白很有可能与抑制反应的补偿性应答有关． 他们认为，这些蛋白含量丰度的增加或降低可能是由于抗菌肽的抗菌作用而引起．所以，这些蛋白可以作为筛选更具抗菌活性的抗菌肽的靶蛋白．; 利用iTRAQ 技术处理了猪肝细胞中的1476 种蛋白对其中880 种蛋白进行分析，在错误识别率小于 5% 条件下,他们发现一些与能量代谢、分解代谢、生物合成、电子传递、氧化还原酶类反应等有关的蛋白含量都大大增加了，这些蛋白在肝脏作为化学和能量工厂这一角色中都起着重要的作用． iTRAQ 技术鉴定了芸苔属植物保卫细胞中的相对蛋白成份． 他们用相对定量的方法在经脱落酸处理过的样品中和对照组中鉴定出 431 种蛋白质．在含量丰度相对上调的 66 种蛋白质中，与应激和防御有关的蛋白占大多数． 38 种蛋白的含