深海霉菌次级代谢产物的肝癌细胞毒活性研究及机制初探-study on the cytotoxicity of secondary metabolites of deep sea mold to hepatocellular carcinoma cells and its mechanism.docxVIP

缩略语索引HR-ESI-MS高分辨电喷雾电离质谱highresolutionelectrosprayionizationmassspectrometry1H-NMR1H核磁共振1Hnuclearmagneticresonance13C-NMR13C核磁共振13CnuclearmagneticresonanceHPLC高效液相色谱highperformanceliquidchromatographyDMSO二甲基亚砜dimethylsulphoxideMALDI-TOF-MS基质辅助激光解析电离飞行质谱MaritxAssistedLaserDesorptionTimeofFlightmassspectrometryDTT二硫苏糖醇DL-DithiothreitolCHAPS3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸TEMEDN,N,N,N-四甲基二乙胺3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonateN,N,N,N-TetramethylethylenediamineTRIS三羟甲基氨基甲烷2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediolAP过硫酸铵AmmoniumpersulphateIAM碘乙酰胺Iodoacetamide2DE双向凝胶电泳two-dimensionalelectrophoresis1深海曲霉次级代谢产物的肝癌细胞毒活性分析及机制初探硕士研究生：王凡羽导师：郭玉教授汤熙翔副研究员摘要目的：本实验室前期分离得到一株深海来源曲霉（Aspergillussp.）,本实验的目的是提取分离纯化鉴定其次级代谢产物结构,然后研究分离得到的新化合物的肝癌细胞毒活性,并对其作用机理进行初步研究，从而筛选出具有明显抗肿瘤活性的化合物。方法：通过小规模发酵，乙酸乙酯萃取次级代谢产物并运用层析法对其进行分离纯化；利用质谱、核磁共振等对纯化的产物进行鉴定；用CCK-8法检测代谢产物对肝癌细胞的细胞毒活性，双向凝胶电泳法测定相关蛋白表达,对其细胞毒活性的作用机制进行初步探讨。结果：通过对曲霉（Aspergillussp.）的次级代谢产物的分离纯化，得到了四个单体化合物，并确定四种化合物分别为sterigmatocystine、anhydroorcinol、1-methoxy-averantin、averufine。其中化合物anhydroorcinol对肝癌细胞的细胞毒活性强，对于正常肝细胞的毒活性却较低。通过对加药组和对照组的肝癌细胞株Bel7402和正常肝细胞株HL7702细胞的双向电泳结果进行比对，发现HL7702几乎找不到变化显著的蛋白点，而在Bel7402中找到15个有显著变化的蛋白点；又对HL7702和Bel7402进行蛋白质比较，以这15个有显著变化的蛋白点为目标，找到Bel7402与HL7702共同所有的蛋白点8个，其中用药组肝癌细胞株Bel7402的2个蛋白点上调，6个蛋白点下调。将这8个蛋白点进行MALDI-TOF/TOF-MS质谱分析鉴定，共得到6个可信结果（p＜0.05），这六个蛋白点分别为KRT8、Keratin,typeⅠcytoskeletal19、Keratin,typeⅠcytoskeletal10、Alpha-enolaseisoform1、Glucose-6-phoaphate1-dehydrogenaseisoformb，还有一个未知蛋白(proteinforIMAGE:3534054)。2结论：1、从曲霉（Aspergillussp.）的次级代谢产物中分离纯化得到四个单体化合物，其中化合物anhydroorcinol对肝癌细胞的细胞毒活性强，对于正常肝细胞的毒活性却较低。2、化合物anhydroorcinol作用于肝癌细胞后，肝癌细胞显著变化的蛋白点15个，其中8个为正常细胞和肝癌细胞共同表达的蛋白点，且2个蛋白点上调，6个蛋白点下调。关键词：深海来源；次生代谢产物；肝癌细胞；蛋白组学3Characterizationofhepaticcarcinomacytotoxicactivityofadeep-seaAspergillussecondarymetabolitesandpreliminarystudyofmechanismAbstractObjective:Wehadseparatedanewsourceofdeep-seaAspergillusspprevious.Here,weaimtoextract,purifythesecondarymetabolitesandidentifytheirstructure.Andthenstudythecytotoxicactivityoftheis