嗜热菌水聚糖酶基因的克隆 表达及酶学性质研究-cloning, expression and enzymatic properties of thermophilic bacteria water polysaccharide enzyme gene.docxVIP

污水污物中的病原微生物。(4)耐热菌对某些矿物有特殊的浸溶能力，对某些金属具有较强的耐受能力，利用这类微生物，为矿产资源的开发提供了有希望的前最。1.2木聚糖酶的研究进展1.2.1木聚糖的结构植物细胞壁主要是由纤维索、半纤维索和木质素等物质组成的。一般木材中，纤维素占4050%，半纤维素占1O30%，*质索占2030%。而且，这些物质也是自然界中最重要的可再生资源。纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，是通过?-l，4糖=(键连接而成的线状结构分子，具有简单的初级结构和l复杂的三级结构[7)。木质素是由聚合的芳香醇构成的复杂聚合物，存在于木质组织中，主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁。半纤维素是自然界中仅次于纤维素含量的第二丰富的可再生资源，是由几种不同类型的单糖构成的异质多聚休，这些糖是五碳糖和l六碳糖。根据主链占多数的糖来命名，主要有木聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖和l半乳葡甘露聚糖等(8)。木聚精是植物体内半纤维素的主要成分，是一种多聚五碳糖，通过?-l，4-施背键连接的木糖聚合物。其侧链上的不同取代基包括:0-乙毗基、4-0-申基-D-葡萄糖酸酸残基、。-L-阿拉伯糖残基等(9)。这些侧链与植物细胞中其它结构性多糖(如木质索、纤维索、果胶寄?)以共价或非共价键连接，组成植物细胞壁。木聚精存在于玉米、麦款、米糠、秸轩、甘煎渣等农副产品中广泛存在。但是这些木聚糖不能够有效地利用[IO)。而且，作为降解产物的低聚木糖具有高附加值，司以作为功能性食品添加剂，具有非由诱人的市场前最[11)。所以，对木聚糖的应用研究成为科学家研究的热点。1.2.2木聚糖酶的概述?-l，4-内切木聚糖酶是指能够随机切割木聚糖主链骨架的?-l，4-糖=仕键，产生木糖和低聚木糖或带有制。链的嘉聚木糖，也称木聚糖酶。;民:在水果糖的完全降解中起主要作用，降解的主要产物为分子量大小不同的法;糖。目前，己对不同环境来源的微生物、动物及植物的木聚糖酶进行了探入的研究。1.2.3木聚糖酶的分类及结构区域最初根据木聚糖酶的物化性质将其分为2类:低分子盐(30kDa)和碱性，凹，高分子量(30kDa)和酸性问。然而，现在发现的有30%不能用这个系统分类，特别是来源于其菌的木聚糖酶[8)。后来引入一个更完善的分类方法。这种方法主要根据催化区的保守氨基酸和疏水簸，将糖背水解酶分为门5个家族(http://www.afmb.univ-mrs.fr/CAZY/)。从这种分类方法可以发现，同一家族的酶不仅在三维结构上类似、而且其分子作用机制及底物特异性也具有相似性。木聚糖酶主要存在于糖背7].解酶的第5、7、8、10、11和43家族。但是，大部分木聚糖酶属于第10和11家族。第十家族的木聚糖酶主要是内切-1，4-?-木聚糖酶(EC32.18)，还有内切-1，3-?-木聚糖酶(EC32.132)和纤维素二糖*解酶。底物特异性研究表明，这些酶不仅作用于木聚糖，也可以作用于低分子盐的纤维索[1匀。这个家族酶具有高分子盐，低等电1点黑，(ω?/此α)沁8桶状的三维结构给等:特点[们1巧3]。通过8个α螺旋束和18个P折扫抨1构成的结构就像一个u色拉碗由p札-α环组成，半径大约为4sA，另一面是由简单的α-?转角组成，半径大约为30A。第十一家族完全由木聚糖酶(EC)组成，其专一作用于底物中的木糖残基。与其它的糖背水1晖，酶家族相比，可以说是真正的木聚糖家族。木聚糖酶在;It结构和l性质上存在很大差异。有些木聚糖酶仅含有单一催化区域，而有些还具有多种非催化区。具有单一催化区的木聚糖酶由于在结构上相对简单，所以在性质与具有多结构域存在较大的差异。这些多结构域包括催化结构区(Cata1yticDomain，CD)，木聚糖结合区(Xylan-bindingDomain，XBD)、纤维素结合区(Cellulose-BindingDomain，CBD)、重复序列(RepeatedSequence)、热稳定区(ThermostabilisingDomain，TSD)、连接序列(LinkerSequence)及未知功能的非催化区等。这些区域不仅在功能上存在较大的差异，在不同的木聚精酶结构的组成上也不同(14)。这些结构的多样性形成了木聚糖酶在性质上的多样性。1.2.4木聚糖酶的催化机制木聚精酶的7].解反应是广义的酸碱催化反应，是由两个酸性氨基酸贱基参与的，其中一个酸性氨基酸作为质子供体，另一个酸性氨基酸作为亲和基团[5.6J。木聚糖酶主要通过两种不同的机制来*解木聚糖的:保留机制(retainingmechanism)和反转机制(invertingmechanism)剑。在保留机制中(图1-la)，当酶与底物相互作用时，首先，作为质子供体的Glu残基将H+质子提供给?-1，4-糖背键上的氧原子，断开C1