生物钟调控一氧化氮no信号的分析-analysis of nitric oxide no signal regulated by biological clock.docxVIP

中文摘要生物钟，又称近昼夜钟或节律（circadianclockorcircadianrhythms），是以大约24小时为周期的生物节律现象。生物钟是生活在地球上的各种生命对地球每日光和温度的循环变化长期适应和演化的结果。从简单的单细胞细菌到复杂的人都有近昼夜节律。在哺乳动物中，同步内部时间和外界环境的因素主要是光因子。对处于持续黑暗中的小鼠施以简短的曝光处理，能够引起时相迁移。谷氨酸是被普遍认为的能够介导光诱导的神经递质。已有研究表明，用谷氨酸短暂处理小鼠视交叉上核能引起小鼠类似光时相迁移，这种变化可以被NMDAR(N-甲基-D-天冬氨酸受体，谷氨酸受体)抑制剂和一氧化氮（NO）信号有效地阻止。NO，作为一种多功能气体信号分子,影响各种生命过程。然而关于一氧化氮和生物钟之间的关系及作用机制却知之甚少。在本研究中，斑马鱼幼鱼的DAF-FMDA荧光染色结果显示在发育初期一氧化氮信号主要定位在斑马鱼的心脏、脊索、匙骨和尾鳍部位并呈现节律性累积。一氧化氮是由一氧化氮合成酶(NOS)催化合成的。斑马鱼基因组含有nos1、nos2a、nos2b三个一氧化氮合成酶。为了阐明一氧化氮节律性产生的分子机制，我们利用实时荧光定量PCR对斑马鱼的三个一氧化氮合成酶(nos1，nos2a，nos2b)的mRNA表达水平进行检测，结果表明三个nos基因在LD(Light：Dark)和DD（ConstantDarkness）状态下都有节律性震荡。为了更好地阐明其表达模式，我们构建了nos2a和nos2b的转基因鱼，证明了一氧化氮合成酶确实受到内在的生物钟控制。同时我们构建了由三个nos启动子驱动的荧光素酶报告系统，进行了体外的细胞共转染实验，发现三个一氧化氮合成酶的节律性表达并不受E-box介导的Bmal1b/Clock1a二聚体和RRE元件介导的Rorα调控而是受D-box元件介导的Tefα调控。说明一氧化氮合成酶受到生物钟控制并不是通过E-box和RRE元件，而是通过D-box受到生物钟控制。另一方面，上半夜对幼鱼实施以100μM的SNP(NO供体)处理使斑马鱼时相延迟，而下半夜100μM的SNP的处理使斑马鱼幼鱼的总体活动量明显高于野生型斑马鱼，并缩短了斑马鱼幼鱼的活动周期。我们同时发现上半夜对幼鱼的SNP处理使I中文摘要生物钟调控一氧化氮(NO)信号机制的研究bmal1b和clock1a基因表达水平上调，而per2和cry1ab的表达水平则下调，在下半夜的SNP处理则使bmal1b和clock1a基因表达不再震荡，per2和cry1ab的表达水平下调。说明一氧化氮信号也能够影响内在生物钟、钟基因及其斑马鱼活动节律性。关键字：一氧化氮，生物钟，一氧化氮合成酶，节律性表达，机制作者：张燕请指导老师：王晗IIThecircadianclockregulatesthenitricoxide(NO)signalinginzebrafishAbstractThebiologicalclocks,alsocalledthecircadianclocksorcircadianrhythms,arebiologicalrhythmsthataredriventoformaroughly24-hourcycle.Thecircadianclocksaretheresultsofthelong-termadaptationandevolutionofavarietyoflifetothedailycycleoflightandthetemperatureonearth.Circadianrhythmscanbefoundinallthelivingthingsfromsimplesingle-celledbacteriatohumans.Inmammals,lightistheprimaryfactortosynchronizeinternaltimeandoutsideenvironment.Thebrieflightpulsecanresultinshiftofthecircadianclockphaseofmiceinconstantdarknesscondition.Glutamate(Glu)istheputativeneurotransmitterthatmediatesphoticentrainment.PreviousstudiesshowedthatbrieftreatmentsofratSCNinvitrowithglutamateresultedinlight-likephaseshiftsofcircadianrhythms,whichcouldbeblockedbyNMDAR(N-methyl-D-asparticacidreceptor,