《单核细胞增生李斯特菌检验》课件.pptVIP

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验;李斯特氏菌属; 单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛存在于自然界中。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都可被污染。该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。 其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷人群。大多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为每一百万人2-15例，死亡率为13-34% 加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌病暴发，导致十几人死亡。很多国家都已经采取措施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应的标准。 ;按2009年国家食源性疾病检测网的工作手册 1.定性检测 2.定量检测;检样 25 g(ml)样品+LB1增菌液225 mL，均质; 增菌培养:LB1增菌液225 mL，于30℃培养24h, 吸取0.1 mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。 分离培养:LB2 二次增菌液转种于选择培养基PALCAM和科玛嘉琼脂平板上，于37℃培养24 h，观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。 ;;表1 单核细胞增生李斯特菌在选择性平板上的菌落特征 选择性琼脂平板单核细胞增生李斯特菌科玛嘉显色培养基菌落为:蓝色，周围有白色晕圈. PALCAM琼脂菌落:为灰绿色，小的圆形菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷;L.M在 Chromagar培养基生长特征;;L.M在OXA培养基生长特征 ;L.M在PALCAM培养基生长特征;MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很难与杂菌区分 进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易与杂菌区分 CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对高污染食品中的杂菌抑制性较差 ;染色镜检 将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为0.4～0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。;该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物中呈短小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状，在老龄培养物中呈长丝的长杆菌状，有些细菌因此而变成革兰氏阴性；为需氧或兼性厌氧菌，在20～25℃培养时能形成4根鞭毛，运动活泼；在37℃培养时无鞭毛，运动消失。????????? ;1.初筛 在我们前期工作中发现，高污染样品在选择性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。 ;初筛及纯培养 自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于37℃培养24h；同时在胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA-YE）平板上划线纯化，于30℃培养24h-48h。木糖阴性为蓝色，鼠李糖阳性为黄色，在TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色。;单增李斯特氏菌生化性状与其种间的区别;动力试验 将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM培养基中，于30℃培养24h-48h，李斯特菌有动力，呈伞状生长。 溶血实验： 将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格，从TSA-YE上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特菌和绵羊李斯特菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特菌)，;于35℃培养24h-48h，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂。 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，无害李斯特菌无溶血环，伊氏利斯特菌产生大的透明溶血环。注意：不要据此来区别李斯特氏各种菌，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来确证李斯特氏各种菌。 ; 协同溶血试验 (cAMP): 在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌 (R.equi), 在它们中两者之间垂直接种可疑李斯特菌, 但不要触及它们, 于30℃培养24h～48 h, 检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强, 斯氏李斯特菌（L.seeligeri）的溶血也增强, 而伊氏李斯特菌（L.ivanovii）在马红球菌附近的溶血增强。;金葡 ;对小鼠的毒力试验 （可选择） 将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中, 于30℃培养24 h, 离心, 弃上清液，用0.85?无菌生理盐水制备成浓度为1010cfu/mL的菌悬液, 取此菌悬液进行小鼠腹腔注射 3～5只, 每只0.5 mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2～5d 内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生利斯特菌、伊氏利斯特菌（L.ivanovii）对小鼠有致病性。;血清学分型:? Lm是根据O抗原和H抗原的差异进