二代测序在遗传性疾病中应用.pdf

中南大学 二代测序技术在遗传性疾病中的应用 中南大学 邓昊 湘雅三医院 中南大学 提 纲 第一代测序介绍 第二代测序介绍 第三代测序介绍 湘雅三医院 中南大学 一、第一代测序介绍 湘雅三医院 中南大学 第一代测序技术是双脱氧链末端终止法 根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特 定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的 一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进 行检测，从而获得DNA序列。 自上世纪90年代初，所有的DNA测序操作几乎无一例外 地全部采用半自动化毛细管电泳Sanger测序法。 湘雅三医院 中南大学 大量的待测序模板片段——质粒或PCR产物。 测序仪进行“循环测序”反应。在每一轮测序反应 的引物延伸步骤中，会随机引入已被四种不同颜色荧光 分别标记的ddNTP（ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP）以 终止延伸反应。这样就形成了大量末端被荧光标记的、 长短不一（终止位点不同）的延伸产物。接着，再用高 分辨率的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物，通过对延 伸产物末端四种不同荧光颜色的区分，计算机软件会自 动“读出”DNA序列。 高通量测序仪一般一次最多只能同时进行96个或384 个样品测序。 湘雅三医院 中南大学 Sanger DNA测序技术经过了30年的不断发展与完善。 现在 已经可以对长达1,000bp的DNA片段进行测序了。 而且对每一个碱基的读取准确率高达99.999%。 在高通量基因组鸟枪法测序操作当中，使用Sanger 测序法的费用大约为0.5美元/1,000个碱基。 湘雅三医院 Sequencing Technology Development 中南大学 Invention of Invention of chemical Heliscope Single degradation single molecule real