信号通路对脑胶质瘤干细胞增ppt课件_2.pptVIP

* 乙方有义务提供相应的执业资格证、执业印章等配合甲方工程招投标、承担的工程项目报建及建设施工过程中各类手续办理。 * SHH 信号通路对脑胶质瘤干细胞增  殖与分化调控作用的实验研究 第三军医大学附属新桥医院神经外科　 　 杨辉 尹昌林 吕胜青 　中国重庆，400037 Fig 1 HH 信号通路的组成和信号传递过程 A、HH 信号通路的组成和信号传递过程，B、HH 信号对GLI 的调控 一、材料和方法 1.严重联合免疫缺陷小鼠（SCID mouse）4～5周龄，雄性，10～15g。 2.总共收集31例新鲜人脑胶质瘤组织标本，按世界卫生组织（WHO）确立的原则进行病理分型和分级；3例正常对照脑组织标本来源于新桥医院神经外科同期癫痫手术病人。 3.U251胶质瘤细胞株,CHG-5胶质瘤细胞株。 1、 人脑胶质瘤组织和细胞株中脑胶质瘤干细胞 的分离和体外培养，参照Singh等的方法，采用人CD133细胞分选试剂盒，以免疫磁珠法进行。 2、体外培养活细胞数测定， 采用CCK-8试剂盒，以WST-8法进行。 3、 BGSCs增殖与分化过程中 SHH 信号通路基因表达的检测 ：采用RT-PCR法检测； 4、BGSCs增殖与分化过程中 SHH 信号通路蛋白表达的检测 ：采用 Western Blotting和免疫荧光技术检测； 5、细胞周期测定：细胞收集、固定后以PI染色，流式细胞术检测分析； 6、细胞比例测定：细胞收集、固定后行免疫荧光单标染色，流式细胞术检测分析。 CD133+细胞从原标本中的1.8%～29.7%提高到46.8%～88.7%，而相应的CD133-细胞群标本中CD133+细胞比例降至1%以下。 图1-1 免疫磁珠法分选前胶质瘤总体及分选后CD133+和CD133-细胞群中CD133+细胞的含量 上排：P1（A 分选前，B CD133+细胞群，C CD133-细胞群） 下排：U251（a 分选前，b CD133+细胞群，c CD133-细胞群） A B C a b c 人脑胶质瘤干细胞生长情况 照片2 肿瘤球经有血清培养基诱导分化4 h ~7 d，肿瘤球首先贴壁并伸出突起（A-4 h），细胞逐步迁移出来呈放射状分布并分化，表型与亲本肿瘤一致（B、C-3 d，D-5 d，E-7 d，F-亲本肿瘤P1例，200×） A B C D E F 照片3 胶质瘤干细胞形成的肿瘤球均表达干细胞标志物Nestin（A）和CD133（B），以Hoechst 33342（C）显示细胞核，经重合检查（D）多数细胞同时表达Nestin和CD133，但细胞表达Nestin的强度高于CD133，表达Nestin的细胞数量多于表达CD133的细胞（400×） A B C D 照片4 胶质瘤干细胞与CD133-胶质瘤细胞超微结构，胶质瘤干细胞和间比较大，突起少，胞浆中细胞器较少，核糖体丰富，为见胶质丝等分化结构，符合干细胞超微结构特点（A 20000×，C 4000×）；CD133-胶质瘤细胞可见较长突起，胞浆内线粒体、粗面内质网等细胞器丰富，属于典型分化细胞的超微结构（B 17000×，D 4000×） A B C D 照片5肿瘤球经有血清培养基诱导分化3 d、7 d，产生GFAP、MAP2、MBP、CD133染色阳性的肿瘤细胞，上排-分化3d（A-GFAP、B-MAP2、C-MBP、D-CD133），下排-分化7 d（E-GFAP、F-MAP2、G-MBP、H-CD133），4种细胞在3 d和7 d所占比例不同（亲本肿瘤P1例，400×） A B C D E F G H 照片7 P1⊕和P1〇移植SCID鼠后8 w成瘤情况：A、SCID鼠，B、处死动物后右侧腋部皮下检视发现成瘤（红色箭头所示），C、移植瘤大小及所对应的移植细胞类型和数量，D、亲本肿瘤呈GFAP阳性染色（400×），E、亲本肿瘤HE染色（400×），F、移植瘤HE染色（400×） A B C D E F 500 bp 250 bp 500 bp 1 2 3 4 图2-1 脑胶质瘤干细 胞中SHH信号 通路基因表达 情况(P1⊕) 上图：脑胶质瘤干细胞中