体外构建大鼠pdx-1基因克隆载体及体外诱导人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化-construction of rat pdx - 1 gene cloning vector in vitro and induction of differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into insulin-secreting cells in vitro.docxVIP

安徽医 安徽医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 10 英文缩略词简表 MSCs mesenchymal stem cells 间充质干细胞 PDX-1 pancreatic duodenal homeobox-1 胰-十二指肠同源框 1 DM diabetes mellitus 糖尿病 DMSO dimethylsulfoxide 二甲基亚砜 bFGF basic fibroblast growth factor 碱性成纤维细胞生长因子 EGF epidermal growth factor 表皮细胞生长因子 IR insulin resistance 胰岛素抵抗 GLP-1 glucagon-like peptide-1 胰高血糖素样肽-1 摘要一  PDX-1 基因克隆载体的体外构建 摘要 目的：构建 PDX-1 基因的克隆载体，为真核表达载体的构建及研究 PDX-1 诱导干 细胞分化的作用机制提供基础。 方法：采用 Trizol 方法从大鼠胰岛细胞瘤细胞株中提取 RNA，通过 RT-PCR 方法 在体外扩增大鼠 PDX-1 cDNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定，割胶纯化后回收目的基因， 与 pMD-18T 克隆载体连接构建，经限制性内切酶双酶切及 DNA 序列分析鉴定 pMD-18T-PDX-1 的正确构建。 结果：正确构建了含有 PDX-1 cDNA 的克隆载体 pMD-18T- PDX-1，其中 PDX-1 cDNA 全长为 908bp。 结论：在体外成功克隆了 PDX-1 基因，并正确构建了 PDX-1 基因克隆载体，对进 一步进行 PDX-1 在真核细胞中的表达及研究 PDX-1 在干细胞定向分化中的作用具 有重要的意义。 关键词：PDX-1 cDNA 胰岛细胞瘤 克隆载体 摘要二  体外诱导人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌 细胞分化 摘要 目的：体外培养人脐带间充质干细胞，将间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细 胞，探讨诱导分化过程中干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能及功能变化趋势。 方法：体外培养人脐带间充质干细胞，培养至贴壁 80%，将间充质干细胞分两组， A 组为诱导组，B 组为对照组。A 组先后予以 1mmol/L 2-巯基乙醇培养 2 天，10ng/ml 表皮生长因子、10ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子及 2% B27 培养 7 天，之后添加 20mmol/L 尼克酰胺及艾塞那肽培养 7 天。B 组不添加试剂，继续换液培养。通过 观察细胞形态变化、RT-PCR 体外扩增两组细胞的 PDX-1 基因的 cDNA、放射免疫法 测定两组细胞胰岛素分泌量三种方法来鉴定胰岛素分泌细胞。 结果：（1）通过形态学观察，可见未分化的脐带间充质干细胞呈长梭形，分界清 楚，传代后细胞呈纤维样生长，而 A 组细胞逐渐变小，呈圆形，折光性变强，细 胞聚集成团，类似胰岛样细胞，B 组细胞仍呈长梭形，分界清楚，纤维样生长；（2） RT-PCR： A 组细胞可扩增出 PDX-1 基因的 cDNA，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，PDX-1 目的片段为 912bp，与 pubmed 公布基因片段符合；B 组细胞不能扩增出人 PDX-1 基因的 cDNA。（3）通过放射免疫法测定两组细胞胰岛素分泌量，A 组可检测出胰 岛素分泌，B 组未检出胰岛素分泌。 结论：成功在体外微环境下将人脐带间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞， 为干细胞在糖尿病治疗领域的应用提供基础。 关键词: 人 脐带 间充质干细胞 Construction of the PDX-1 cloning vector in vitro Abstract Objective: To build the PDX-1 gene cloning vector for constructing eukaryotic expression vector and studying the mechanisms of stem cell differentiation induced by PDX-1. Methods: RNA was extracted from insulinoma cell line of rat by Trizol method, PDX-1 cDNA was amplified by RT-PCR method in vitro, nucleoside sequence was identified by agarose gel electrophoresis, and then the fragment was inserted into pMD-18T cloning vector. The recombinant cloning vector pMD-18