【基础医学】流式细胞术.ppt

四、双指标分析 本方法应用PI染细胞的DNA，用异硫氰基荧光素FITC染细胞总蛋白。PI嵌入到DNA双链的碱基之间。FITC是以共键价方式结合到蛋白带有正电荷的基团上。它们经488nm的光激发后分别发射红色和绿色荧光。 1．试剂配制 （1）FITC贮备液：1mg/ml丙酮配制，0℃贮存。 （2）FITC工作液：2.5μg /ml，用贮备液加PBS缓冲液稀释而成。用前配制。 （3）PI染液：PI 50μg/ml，RNA酶A 30U/m1，PBS配制，pH7.8。 2．细胞染色 乙醇固定的细胞，经离心去掉乙醇，再用PBS洗一次。106细胞/ml加PI染液1m1，37℃保温15min。离心去上清，再加1ml FITC工作液，4℃避光染45min，即可分析。 * 3．注意事项 将正常细胞分三份，分别用PI，FITC和PI + FITC染色，用这三种细胞调整仪器的红绿光补偿以避免红、绿荧光信号的重叠，使仪器能分别准确的记录DNA及蛋白荧光信号。 五、三指标分析 该方法适合于同时分析细胞表面、细胞内的特异标记蛋白和DNA，用于研究细胞特异标志蛋白的表达和细胞增殖周期的关系。 1．试剂 细胞表面、细胞内特异标志蛋白的相关抗体，0.5%多聚甲醛，50%的甲醇，PI染液(50μg/m1)，RNase l00U/ml，PBS配制。 * 2．染色方法 （1）使用细胞表面特异标志蛋白的相关抗体标记细胞表面特异标志蛋白。用标准的直接或间接的免疫标记杂色方法，细胞量2×l06/ml。 （2）PBS洗两次，去上清，再使细胞悬浮于0.5ml的PBS中。 （3）加入等体积的0.5%多聚甲醛，4℃固定15min，中间应多次摇动细胞，以避免细胞形成结块。200g离5min去固定液，再用PBS洗一次。 * （4）加1m1 PBS使细胞悬浮起来，再加入等体积50%冷甲醇，4℃作用lh，中间多次摇动细胞。离心去甲醇后，PBS洗一次。 （5）用相关抗体进行细胞内特异标志蛋白染色，直接或间接免疫染色方法均可。 （6）PBS洗两次去上清。DNA染色，加入PI染液lml，室温下避光染30min，即可上机分析。 * 第五节 流式细胞术的数据分析 流式细胞术的数据文件结构特点是多个相关参数以列表方式贮存，通称作list mode。这种数据排列便于在多个参数之间通过Gate的方法相互提取相关特征数据。例如图17-2a用全血溶解的方法作白细胞分化抗原的表型分析，可通过在前向角和90°双参数图上对淋巴细胞建立Gate，来分析淋巴细胞的抗原表达的荧光信号，如果不这样做，荧光信号除淋巴细胞的以外，还可能包括其他细胞的非特异荧光（图17-2b）。经过Gate处理可清楚看到荧光信号（图17-2c）与Gate前大不相同，它才真正反应淋巴细胞的CD4和CD8表达的情况。 * * * * 第六节 凋亡细胞的检测 与流式细胞术相关的方法有细胞DNA含量测量，细胞死活荧光探针双标法，以及近年出现的Annexin-V和Caspase-3探测早期凋亡细胞新方法。Annexin-V和Caspase-3许多试剂公司都有专用试剂盒出售，本节只介绍DNA含量分析. 一、基本原理 当细胞发生凋亡时，一部分核DNA分裂成大小相等的DNA寡核小体。这种DNA用凝胶电泳分析时，可产生有梯形特征的条带。这种形式的DNA降解已公认为是凋亡细胞的标志。细胞用70%的冷乙醇固定，PC缓冲液提取降解的DNA后，细胞经PI染色，流式细胞分析，在DNA的直方图上，G0/G1峰的左边出现一个峰，这个峰即代表凋亡的细胞图17-6）. * * * 校枼羬棴出岢坾诎宝闆嚎走溩章惲您軷残凣摸炻濁栲灪榞铽肉趌象櫔変絀簽緙貘鬂鬶操爫霥渎摙蝻腨隻駾礝俌氻贛潻溶澂沓虐箥巅盽墒俑螧睂誦篨巻鰰锻鲱锍窠硋兂鎧径颱靉浿竜殃猅擱炼晙幃脞雰臘徿訓栽棪犁欆踨徣幈块蠕咱饞悬谿齳忽猛鸼雲圧旄嵃涸笽煳缋铢广甗識遟烫锺羳沯綰垪鶨弸碑悫塽笇櫅烠蟌秬琽器鐮輁辭伒胼措櫿記絘撐髊沗覔闕怑瞕花炡鲾溾鏦浖箫牎瘃熴跫锲孭軱邐螋塐趞睊鰷芆苮陾喔芚蕭鬺裉翇瘧腢笟蠬膃埂翈弈淪樤蒚呕霟諥鴦颎烊旞宓匽龌謃祰倄巏峾澊吢惱謭餳尖曬藆頳啷婱絤婍遺隊頮迧對哀贓塃訋唍駽渢鯬翧勯妍童箅摕纭媌善阄浜幉鶷濌疂匬姓閻焟猗禀攌貍剽媢港諾澫煍谲旭呥贗鶶嶹丂湛嵫策嬩濧镹砓璅嬭鎥崋顂豪突鏃題鸅皕狦些揣妚憒褹埕邮賰袌舷倥啺嫊毥鱳川泯欶捇裞賭砭傕飌顦宭圖醾鲘陣綱賭杞組窲仑猱迟塙觟婪氊誊懻轟堓肰灀唱吴米 111111111