体外多胺微环境对人肝癌细胞hepg2和smmc-7721迁移的影响-effects of polyamine microenvironment on the migration of human hepatoma cells hepg 2 and smmc - 7721 in vitro.docxVIP

 I  PAGE 4 摘 要 实验背景： 肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是常见的一种恶性肿瘤，在全世界范围内， 亦是发病率和致死率最高的肿瘤之一，其致死率在肿瘤疾病中位居第三位。虽然近年来 使用早期诊断、化疗、放疗和手术治疗等方法使肝癌的疗效有一定的提高，但是肝癌患 者的预后仍不理想。多胺是一类带正电荷的小分子脂肪族化合物，包括腐胺（putrescine， Put）、亚精胺或精脒（spermidine，Spd）和精胺（spermine，Spm），是生命活动中不 可或缺的生命物质，具有广泛的生理及病理生理作用，如促进细胞分裂增殖、分化以及 凋亡等。最近有文章显示体内多胺含量的变化和 Akt1 的高表达密切相关，但是在肝癌 中多胺和 Akt1 的生物学功能及分子机制仍然不清楚。 实验目的: 多胺是一种带正电荷的小分子脂肪族化合物，包括腐胺（putrescine，Put）、亚精 胺（spermidine，Spd）和精胺（spermine，Spm）。它广泛存在于自然界中，例如：动 植物细胞、细菌、原核细胞、酵母菌和病毒中都含有一定的多胺，它是大多数生命器官 天然组份中所必需的。在正常生理情况下，多胺在人体组织和体液中的含量非常少；而 在病变的肿瘤组织中多胺的含量明显高于正常组织，并且肿瘤的生长、侵袭和迁移均与 细胞内多胺的含量有关。本实验通过采用低、中、高三种不同浓度的多胺处理肝癌细胞， 观察多胺微环境对肝癌细胞生长、迁移、侵袭等能力的影响，并探究其相关分子作用机 制。 实验方法： 选取人肝癌细胞 HepG2 和 SMMC-7721 作为研究对象，首先用基因转染技术把 Akt1 基因转入 HepG2 细胞和 SMMC-7721 细胞中，将三种不同浓度的外源性多胺按低浓度 （腐胺 0.008 nmol/mL、精胺 0.05 nmol/mL、精脒 0.1nmol/mL）、中浓度 （腐胺 0.08 nmol/mL、精胺 0.5 nmol/mL、精脒 1.0 nmol/mL）和高浓度 （腐胺 0.8 nmol/mL、精胺 5.0 nmol/mL 精脒 10.0 nmol/mL）分别加入含定量培养基的 HepG2 细胞、HepG2-Akt1 细胞、SMMC-7721 细胞和 SMMC-7721-Akt1 细胞中。每一种细胞都设阴性对照组，培 养 15 天和 30 天。采用细胞划痕实验和 Transwell 迁移实验（未铺胶）检测不同浓度的  多胺对四种细胞迁移能力的影响；采用克隆形成实验检测不同浓度的多胺对四种细胞增 殖能力的影响；采用蛋白免疫印迹实验（Western blot）检测 Akt1、Akt、基质金属蛋白 酶（ MMP9 ） 、 鸟 氨 酸 脱 羧 酶 （ ornithine decarbo-xylase, ODC ） 、 低 氧 诱 导 因 子 （hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、P27kip1、整合素（Integrin α6）、精脒/精胺乙 酰转移酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase，SSAT）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等蛋白在不同浓度多胺微环境下的变化。 实验结果： HepG2 细胞、HepG2-Akt1 细胞、SMMC-7721 细胞和 SMMC-7721-Akt1 细胞在不 同浓度多胺微环境下表现出不同的增殖、侵袭和迁移能力，并且随着多胺浓度的升高其 增殖、侵袭和迁移能力逐渐增强，并且表现出时间剂量依赖性。蛋白免疫印迹实验结果 表明多胺可通过诱导鸟氨酸脱羧酶（ODC）、精脒/精胺乙酰转移酶（SSAT）、Akt1、 整合素（Integrin α6）、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMP9）、低 氧诱导因子（HIF-1α）等蛋白的表达上调以及下调 P27kip1 蛋白表达促进肿瘤细胞的增殖、 侵袭及转移。 实验结论： 高浓度多胺微环境促进 HepG2 细胞、HepG2-Akt1 细胞、SMMC-7721 细胞和 SMMC-7721-Akt1 细胞 增殖、侵袭 和 迁移 等 能力 ，并 且 HepG2-Akt 细胞 和 SMMC-7721-Akt1 细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显高于 HepG2 细胞和 SMMC-7721 细 胞，表明 Akt1 于多胺微环境条件下在促进肿瘤迁移的过程中发挥着重要作用。 关键词：肝癌；多胺；Akt1；迁移；增殖 III  PAGE 6 ABSTRACT Background: Hepatocellular carcinoma (HCC) is one