深入分析rig-g抑制肿瘤细胞增殖的分子机制-in - depth analysis of the molecular mechanism of rig - g inhibiting tumor cell proliferation.docxVIP

上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 硕士研究生论文 - - PAGE 1 - 深入研究 RIG-G 抑制肿瘤细胞增殖的分子机制 摘 要 RIG-G （ retinoic acid-induced gene G ）是从急性早幼粒细胞白血病（ Acute Promyelocytic Leukemia，APL）细胞系 NB4 中克隆得到的一个可被维甲酸诱导表达 的基因。该基因位于 10q24，其 cDNA 全长 1919bp，编码的蛋白分子量约 60kD。研 究表明，除 NB4 细胞外，在多种肿瘤细胞（包括白血病细胞和实体瘤细胞）中，RIG-G 基因都可以被维甲酸和/或干扰素显著地诱导表达。有关 RIG-G 基因功能的研究表明， RIG-G 可以通过上调细胞内 p27 和 p21 蛋白的水平来抑制肿瘤细胞增殖。 在以前的工作中，我们曾发现 RIG-G 可以与 JAB1 蛋白发生相互作用，并将后 者阻滞在细胞浆中，无法正常携带磷酸化的 p27 蛋白出核，从而抑制了 p27 蛋白通 过胞浆的泛素/蛋白酶体系统降解。近年来的研究显示，JAB1 是 COP9 信号体（COP9 signalosome，CSN）复合物的一个亚基，也被称为 CSN5。CSN 是一个多亚基复合物， 在哺乳动物细胞中由 9 个亚基组成，主要存在于细胞核中。CSN 复合物具有多种功 能，可在胚胎发育、细胞周期调控、血管生成以及维持微环境稳态等多种生命活动 中发挥重要作用。据文献报道，CSN 复合物可以调控一类含 cullin 和 RING 蛋白的 E3 泛素连接酶复合物（cullin-RING-ligases，CRLs）的活性和稳定性，并继而影响细 胞内蛋白质的泛素化。在 CRLs-E3 连接酶所识别的靶蛋白中包含一些与细胞周期密 切相关的调控因子如 p27、p21、cyclinD 等，这些蛋白的泛素化对于保证细胞周期的 正常进行至关重要。细胞中的 CSN 复合物一旦发生异常即会引起细胞周期紊乱，最 终导致疾病包括肿瘤的发生。由于 RIG-G 可以影响 JAB1/CSN5 在细胞内的分布和功 能，那么，RIG-G 是否也会影响 CSN 复合物的功能呢？本课题通过研究 RIG-G 对 CSN 复合物组成以及功能的影响，对 RIG-G 如何调控 p27 和 p21 蛋白、抑制细胞增 殖的分子机制进行了深入的探讨。 我们以可诱导表达 RIG-G 的稳转细胞株 U937T-RIG-G 及其对照细胞 U937T-pTRE 为研究对象，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶过滤层析等实验， 发现 RIG-G 可以改变 CSN 复合物的组成。进一步利用 Western blot、RT-PCR、蛋白 降解抑制和合成抑制等试验，我们又发现 RIG-G 可以使 CRL-E3 连接酶中的亚基 cullin1 以及 Skp2 的蛋白水平下降，表明 RIG-G 的确可以通过改变 CSN 复合物的组 成影响其功能。CRL-E3 连接酶的稳定性下降，会直接使 p27 蛋白在细胞核内的泛素 化受到抑制，导致其无法降解而在细胞内累积。 此外，我们发现 RIG-G 还可以抑制 c-Jun 蛋白的磷酸化。c-Jun 蛋白磷酸化水平 的降低会抑制 c-myc 基因的转录，进而促进 p21 基因的表达。RIG-G 的这种抑制作 用很可能也是因为 CSN 复合物水平的下降引起的。 总之，本课题在原有工作基础上深入研究了 RIG-G 对 CSN 复合物组成和功能的 影响，进一步阐明了 RIG-G 上调 p27 和 p21 的机制。本研究对于全面理解 RIG-G 抑 制肿瘤细胞增殖的作用具有重要意义。 关键词： 维甲酸诱导基因 G；CRL-E3 泛素连接酶； COP9 信号体复合物；蛋白降解 Investigation on Molecular Mechanism of Inhibitory Effect of RIG-G on Tumor Cell Proliferation ABSTRACT RIG-G, a retinoic acid-induced gene, was originally cloned from an acute promyelocytic leukemia cell line NB4. It was mapped on chromosome 10q24. The full length of RIG-G cDNA is 1919bp, coding for a protein of about 60kD. It has been reported that, in addition to NB4 cells, the expression of RIG-G gene ca