体外重建人工红细胞膜蛋白的免疫荧光法分析及其功能特性分析-immunofluorescence analysis and functional characteristics analysis of artificial erythrocyte membrane protein reconstructed in vitro.docxVIP

摘要传统的输血法不能完全解决临床医疗和战场急救等情况下存在的一些实际问题，血液代用品的研究应运而生。发展至今，人们已经研制出三代血液的代用品，其中，以第三代人工构建的红细胞与天然红细胞在结构、性质上更为接近，有趋于天然红细胞的携氧-释氧能力。本课题对基于细胞骨架重建的红细胞其蛋白结构、力学性质及携氧能力进行研究的基础上重点利用免疫学方法对红细胞构建过程中的膜蛋白进行定位示踪，从微观角度提供了体外重构红细胞的可行性的直观证据，同时也为人工红细胞的结构研究提供了新的途径。目的：研究人工红细胞功能及性质，并且建立免疫技术对体外重建红细胞膜结构蛋白研究的方法学，为血液代用品的研究提供新的参考。方法：制备人工红细胞，观测其氧饱和-解离曲线（P50）和粘弹性等参量，分析所得人工红细胞的携氧能力及其理化性质，并通过免疫荧光的手段，实现对重建人工红细胞膜蛋白的原位标记，以获得膜蛋白的结构和分布。结果：本课题所制得的人工红细胞弹性和表体比均接近于天然红细胞，其数值在天然红细胞的范围内。通过氧亲和力的测定，得到天然红细胞的P50为26.93，样品人工红细胞P50值为15.67，数值上略有差异，说明了人工红细胞的氧亲和力优于天然红细胞。从荧光免疫结果来看，以荧光标记兔抗人免疫球蛋白为抗体，采用间接免疫荧光染色法对红细胞膜蛋白spectrinal原位标记，在激光共聚焦显微镜下以488nm蓝光激发荧光，通过对比天然红细胞和人工红细胞的spectrin分布，分析人工红细胞的构象和重建的过程。与天然红细胞类似，人工红细胞在膜上有血影蛋白分布，且较天然红细胞更为均匀。结论：在形态上，重建人工红细胞类似于天然红细胞，形态结构上的性质与其生物力学和携氧-释氧的功能密切相关。细胞稳定性测试结果显示，人工红细胞能够以稳定结构存在，并且保持良好的生理生化指标，通过对其膜蛋白特异荧光定位分析，可以看出人工红细胞和天然红细胞一样在膜上分布有特定结构蛋白，说明在细胞体外重建的过程中，膜蛋白根据生物力学原理进行了随机结合排列，对重建过程进行蛋白荧光定位分析，其结果进一步揭示了人工红细胞的体外构建过程。关键词：人工红细胞，功能鉴定，膜蛋白定位，免疫荧光ABSTRACTTherearesomepracticalissuestotraditionalmethodtosolvealltheclinicaltransfusionmedicineandbattlefieldfirstaidcases,sostudyofbloodsubstitutesemerge.Developmentsofar,ithasbeendevelopedthreegenerationsofbloodsubstitutes.Thethirdgenerationofartificialredbloodcellismoreclosetonaturalredbloodcellinitsstructureandproperties,andhasabilityofcarryingandreleasingoxygen.Thissubjectismainlyaboutproteinstructure,mechanicalpropertiesandoxygen-carryingcapacityofartificialredbloodcellwhichisreconstructedbasedoncytoskeleton.What’smore,wedosomeresearchaboutlocatingmembraneproteinoftheprocessofreconstructingredbloodcellaccordingtoimmunologicalmethods.Sothatitprovidesavisualevidenceofreconstructingredbloodcellinvitrofromthemicroscopicpointofview.Aswellasprovidinganewwaytoresearchonthestructureofartificialredbloodcell.Objective：Researchingonthefunctionandpropertiesofartificialredbloodcell,andestablishingamethodologyaboutresearchingthemembraneproteinstructureoferythrocytewhichisreconstructedinvitrobyimmunologicalmethods.Thenprovideanewinformationforresearchingonbloodsubstitutes.Metho