褪黑素对小鼠胃癌抑制作用及其与cd4cd25treg细胞和tgf-β信号通路的关系-inhibitory effect of melatonin on gastric cancer in mice and its relationship with cd 4 cd 25 treg cells and tgf - β signaling pathway.docx

PAGE PAGE 5 褪黑素对小鼠胃癌抑制作用及其与 CD4+CD25+ Treg 细胞 和 TGF-β 信号通路的关系 摘 要 胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展机制尚不明确，提高机体对 肿瘤的免疫效应是目前生命科学领域的研究热点之一。CD4+CD25+ 调节性 T （Treg）细胞具有免疫无能和免疫抑制两大特征，对肿瘤发生发展有负调节作用， 与胃癌预后呈负相关。前期大量研究证实褪黑素有抗肿瘤及免疫调节作用，而褪 黑素与胃癌、Treg 细胞三者之间直接联系的研究尚未见公开报道。本研究旨在探 讨褪黑素对小鼠胃癌抑制作用及其与 CD4+CD25+ Treg 细胞和 TGF-β 信号通路的 关系及相关机制，为胃癌寻找一条基于神经-内分泌-免疫-肿瘤网络的综合治疗模 式的新思路。 1. 褪黑素体内抗小鼠胃癌作用及其与 CD4+CD25+ Treg 细胞的关系 为研究褪黑素体内抗小鼠胃癌作用及其与 CD4+CD25+调节性 T 细胞的关系， 本部分研究建立荷胃癌小鼠模型，不同浓度褪黑素干预后，运用流式细胞术、实 时荧光定量 RT-PCR、免疫荧光双染色法、免疫印迹法、ELISA 等方法检测 CD4+CD25+ Treg 细胞及相关因子的表达变化。结果表明褪黑素能够缩小荷胃癌 小鼠的肿瘤体积，减轻肿瘤重量，达到抗肿瘤作用；褪黑素在抑制肿瘤过程中下 调肿瘤组织的 Treg 细胞及 Foxp3 表达，且能使荷胃癌小鼠的胸腺、脾增加的 Treg 细胞数及增高表达的 Foxp3 蛋白恢复到正常水平，但对脾 Foxp3mRNA 有上调作 用；褪黑素还使荷胃癌小鼠外周血清升高表达的的 TGF-β1 下降到正常水平。表 明褪黑素抗肿瘤的途径之一是降低体内 Treg 细胞数。 2. CD4+CD25+ Treg 细胞在褪黑素体外抗小鼠胃癌细胞增殖中作用 为研究褪黑素体外抗小鼠胃癌细胞增殖作用及其与 CD4+CD25+ Treg 细胞的 关系，本部分建立不同浓度褪黑素干预胃癌细胞模型，并选择性加入 Treg 细胞 或 CD4+CD25- T 细胞共培养，运用细胞免疫磁珠分选、流式细胞术、荧光双标 染色、CCK-8、ELISA 等方法检测胃癌细胞增殖活性及细胞周期变化。结果表明 褪黑素抑制胃癌细胞的增殖，呈剂量依赖性，并与细胞周期 G2/M 期阻滞有关； CD4+CD25+ Treg 细胞在体外对褪黑素抑制肿瘤细胞增殖过程中未起拮抗作用。 3. 褪黑素对胃癌细胞与 CD4+CD25+ Treg 细胞共培养体系相关因子的影响 为进一步研究褪黑素对细胞共培养体系影响的可能机制，本部分沿用小鼠胃 癌细胞与 Treg 细胞或 CD4+CD25- T 细胞共培养体系，褪黑素进行干预后，运用 实时荧光定量 RT-PCR、双荧光素酶报告基因系统、免疫组化、免疫印迹法等方 法探讨褪黑素对共培养体系中相关因子 Foxp3 及 survivin、caspase-3 的影响。结 果发现褪黑素在抑制胃癌细胞增殖过程中对共培养的 Treg 细胞的 Foxp3mRNA 表达有明显上调作用，并呈剂量依赖性，但褪黑素未能明显增高 Foxp3 启动子的 转录活性。褪黑素降低胃癌细胞 survivin 的表达，进而激活 caspase-3 的活性， 是褪黑素体外抑制胃癌细胞增殖的作用机制之一；而与胃癌细胞共培养的 Treg 细胞对胃癌细胞 survivin 的表达有上调作用，CD4+CD25- T 细胞则明显增敏了褪 黑素对胃癌细胞的 survivin 及 caspase-3 的影响。 4. TGF-β 信号通路在褪黑素体内外抑制小鼠胃癌细胞增殖中的作用 为研究 TGF-β1 在褪黑素抑制胃癌细胞增殖过程中的作用，本部分研究体内 实验沿用第一部分动物模型，探讨褪黑素对荷胃癌小鼠胸腺、脾、肿瘤组织 TGF-β1 基因转录与翻译水平表达的影响；体外实验则建立不同浓度褪黑素在不 同时间点干预胃癌细胞模型，利用 TGF-β1 细胞因子刺激、抗 TGF-β1 中和抗体 阻断、反义核酸技术沉默 TGF-β1 表达等手段探讨 TGF-β 信号通路在褪黑素抑制 胃癌细胞增殖中的作用。结果发现褪黑素在体内抑制胃癌过程中上调肿瘤组织的 TGF-β1 表达，且使荷胃癌小鼠胸腺 TGF-β1 表达明显下调，同时使脾下调的 TGF-β1 表达恢复到正常水平。褪黑素体外抑制胃癌细胞增殖过程中，伴有 TGF-β1 表达增高，呈时间依赖性。SiRNA 介导的 TGF-β1 沉默和抗 TGF-β1 中 和抗体联合应用彻底阻断 TGF-β1 通路，能显著拮抗褪黑素对胃癌细胞生长增殖 的抑制，同时促使 MFC 细胞的 G1 期向 S 期转变，提示 TGF-β1 参与细胞正常 生长增殖的调控，褪黑素抑制胃癌细胞增