细粒棘球蚴重组抗原14-3-3和苹果酸脱氢酶诱导宿主dc-cd4t细胞免疫应答机制的研究-study on immune response mechanism of host dc - cd4t cells induced by recombinant antigen 14 - 3 - 3 and malate dehydrogenase of echinococcus granulosus.docxVIP
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- 2018-08-07 发布于上海
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细粒棘球蚴重组抗原14-3-3和苹果酸脱氢酶诱导宿主dc-cd4t细胞免疫应答机制的研究-study on immune response mechanism of host dc - cd4t cells induced by recombinant antigen 14 - 3 - 3 and malate dehydrogenase of echinococcus granulosus
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宁夏医科大学硕士研究生学位论文中文摘要
宁夏医科大学硕士研究生学位论文
中文摘要
细粒棘球蚴重组抗原 14-3-3 和苹果酸脱氢酶诱导宿主
DC-CD4+T 细胞免疫应答机制的研究
摘 要
目的:
通过比较不同免疫保护力的细粒棘球蚴重组抗原 14-3-3(rEg14-3-3)和线粒体苹 果酸脱氢酶(rEgmMDH)对宿主树突状细胞(dendritic cell,DC)的成熟、DC 细胞 递呈并促进 CD4+T 细胞活化、分化及效应的影响,研究细粒棘球蚴抗原所诱导的宿主 免疫应答机制。
方法:
1.抗原的获取:①重组抗原的表达:通过原核表达以及亲和层析纯化获得细粒棘 球蚴重组抗原 rEg14-3-3 和 rEgmMDH,并复性获取可溶性蛋白 rEgmMDH;②天然粗 抗原的制备:外科手术剥离细粒棘球蚴病人的包囊并无菌收集囊液和分离原头蚴,原 头蚴经液氮研磨和超声破碎获取可溶性抗原。
2.小鼠骨髓来源的 DC(BMDC)的制备和培养:无菌分离小鼠骨髓细胞,通过 GM-CSF、IL-4 定向培养 7 天,获取未成熟 DC。
3. 不同抗原刺激 BMDC 的扫描电镜及流式细胞术检测: LPS 、 rEg14-3-3 、 rEgmMDH、原头蚴粗抗原和囊液分别刺激未成熟 BMDC 48 小时,扫描电镜观察各组 BMDC 表面形态特征,流式细胞术检测各组 BMDC 的表面分子(MHCⅡ、CD40、 CD80 和 CD86)和极化因子(IL-12 和 CCL2)的表达水平。
4.混合淋巴细胞反应(MLR)及流式细胞术检测:无菌分离正常小鼠脾脏单个淋 巴细 胞 , 通过 磁 珠 分选 分 离纯 化 小 鼠脾 脏 初始 CD4+T 细胞。 LPS 、rEg14-3-3、 rEgmMDH、原头蚴粗抗原和囊液刺激培养的 BMDC 分别与初始 CD4+T 细胞按 1:5 的 比例混合培养 5 天。流式细胞术检测混合淋巴细胞反应(MLR)后 Th1,Th2,Th17 和 Treg 细胞占 CD4+T 细胞的比例。
II
结果:
.获得高纯度的可溶性重组抗原 rEg14-3-3 和 rEgmMDH,以及无菌的囊液抗原和 原头蚴可溶性抗原。
.①扫描电镜观察结果显示 LPS、rEg14-3-3、rEgmMDH、SPA 和 HF 抗原刺激的 DC 细胞均有部分分化为具有树突状突起的 DC。②流式细胞术检测各组抗原刺激 BMDC 的结果显示,与 PBS 相比,相应浓度的 LPS、rEg14-3-3、rEgmMDH、原头蚴 可溶性抗原和囊液均能刺激 BMDC 高表达 MHCⅡ类分子和 CD40(P<0.05)。与 PBS 相比,BMDC 在相应浓度的 LPS、rEg14-3-3、原头蚴可溶性抗原刺激后,可高表达 CD80 和 CD86(P<0.05),而相应浓度的 rEgmMDH 刺激的 BMDC 低表达 CD80(P
>0.05),相应浓度的囊液刺激的 BMDC 低表达 CD86(P>0.05)。③比较分析 rEg14-3-3 组和 rEgmMDH 组 BMDC 表面分子的表达水平,经抗原 rEg14-3-3 刺激后的 BMDC 较高水平表达 MHCⅡ类分子、CD80 和 CD86(P<0.05)。④相应浓度的 LPS 和 rEgmMDH 能刺激 DC 表达较高水平的极化因子 IL-12(P<0.05),相应浓度的 rEg14-3-3 和囊液能刺激 DC 表达较高水平的极化因子 CCL2(P<0.05)。
.流式细胞术分析混合淋巴细胞反应后的 CD4+T 细胞,结果显示,①与 PBS 相 比, LPS 、 rEg14-3-3 和 rEgmMDH 能 诱 导 初 始 CD4+T 细 胞 分 化
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