小脑顶核调节免疫系统功能中枢和外周途径-cerebellar fastigial nucleus regulates central and peripheral pathways of immune system function.docx

小脑顶 小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径 中文摘要 中文摘要 中文摘要 小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径 小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径 中文摘要 目 的： 我们实验室以前的研究表明小脑顶核可参与调节淋巴细胞功能。由于小脑与免疫 系统之间没有直接的结构上的联系，因此探讨小脑调节免疫功能的途径和机制对于更 好地理解小脑的免疫调节功能具有重要的意义。下丘脑是中枢神经系统中重要的免疫 调节中枢。为此，本研究一方面进一步揭示小脑顶核至下丘脑的神经投射路径及性质； 另一方面，在上述研究的基础上分别研究小脑顶核至下丘脑 γ - 氨基丁酸（ γ -aminobutyric acid, GABA）能和谷氨酸能神经投射对淋巴细胞功能的影响，以探讨小 脑顶核调节免疫功能的中枢和外周途径，进一步拓宽和加深对小脑神经免疫调节的认 识和理解。 方 法： 1. 单侧小脑顶 核内 微量 注射 葡聚 糖 -德 克萨 斯红 （Texas red dextran amine, TRDA），顺行追踪顶核至下丘脑的神经投射路径及终止部位。单侧下丘脑外侧区 （lateral hypothalamic area, LHA）内微量注射逆行追踪剂红色荧光金（Fluoro-Ruby, FR），结合 GABA 和谷氨酸免疫荧光组织化学染色，进一步确定顶核至下丘脑投射的 性质。 2. 双侧小脑顶核内微量注射 GABA 降解酶—GABA 转氨酶的抑制剂氨已烯酸 （ vigabatrin, VGB ）或 GABA 合 成 酶 — 谷氨 酸 脱 羧 酶 的 抑 制 剂 3- 巯基丙酸 （3-mercaptopropionic acid, 3-MP），并以未作任何处理的空白大鼠和双侧小脑顶核注 射等量生理盐水的大鼠作为对照。注射后第 3 天，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 （carboxyl fluorescein succinimidyl ester, CFSE）和抗 CD3 抗体流式双标技术检测 T 淋巴细胞对刀豆蛋白 A（concanavalin A, Con A）刺激的增殖反应；用酶联免疫吸附 法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测血清中抗绵羊红细胞（sheep red blood cells, SRBC）特异性 IgM 抗体水平；动物于第 6 天加强注射药物，3 天后用 CAM/EH-1 流式双标技术检测脾脏自然杀伤（natural killer, NK）细胞杀伤肿瘤靶细胞 I PAGE PAGE VI III III YAC-1 的活性。在检测淋巴细胞功能的同时，用 FR 逆行追踪结合 GABA 免疫组化 染色检测顶核至 LHA 投射中 GABA 能神经元数目的变化，并用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）检测下丘脑中 GABA 的含量变化。 3. 大鼠用小牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）进行免疫。免疫后第 3 天，双侧小脑顶核内微量注射谷氨酸合成酶—谷氨酰胺酶的抑制剂 6-重氮-5-氧代-L- 正亮氨酸（ 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, DON ），同时双侧 LHA 或丘脑腹外侧核 （ventrolateral thalamic nuclei, VL）内微量注射谷氨酸膜转运体抑制剂苏式-3-羟基天 冬氨酸（D,L-threo-β-hydroxyaspartic acid, THA）。动物饲养 3 天，用抗 CD3，CD4， CD8，CD45RA 和 NKR-P1A 抗体标记流式检测外周血中 T 细胞及其亚群，B 细胞和 NK 细胞的百分比变化；用 CD3/CD25 和 CD3/CFSE 流式双标技术分别检测肠系膜淋 巴结 T 细胞对 Con A 刺激的活化和增殖能力；用 real-time PCR 法检测淋巴结 T 细胞 中细胞因子 IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-5，IL-10，TGF-β，IL-22，IL-17 mRNA 的表达 及用 ELISA 法检测细胞培养上清中细胞因子 IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-10，TGF-β，IL-22， IL-17 的水平。此外，大鼠 B 细胞抗 BSA IgM 和 IgG 抗体生成能力及脾脏 NK 细胞的 杀伤活性也分别用 ELISA 法及流式细胞术进行检测。在检测上述淋巴细胞功能的同 时，同样用 FR 逆行追踪结合谷氨酸免疫组化染色检测顶核至 LHA 投射中谷氨酸能 神经元数目的变化，以及用 HPLC 法检测下丘脑及丘脑组织中谷氨酸含量的变化。 4. 注射 DON 及 THA 后第 3 天