特发性和心脏损伤后缩窄性心包炎的纤维钙化机制分析-analysis of fibrous calcification mechanism in idiopathic and constrictive pericarditis after cardiac injury.docxVIP

特发性和心脏损伤后缩窄性心包炎的纤维钙化机制研究 第二军医大学博士学位论文 -  PAGE 13 - -  PAGE 12 - 摘 要 目的：近年来，特发性和心脏损伤后缩窄性心包炎（Idiopathic and post–cardiac-injury constrictive pericarditis, IAPCP）的发病率逐年上升，已成为心包疾病防治领域中一个 亟待解决的重要问题，也是影响心脏手术病人生存质量的一个关键因素。最新研究进 展表明心包纤维钙化是 IAPCP 产生心包缩窄症状的主要原因，但其具体的发病机制 尚不清楚，临床上无有效药物和非手术干预方法。因而，我们以此为切入点，从基因、 细胞及组织三个不同的层面深入探索 IAPCP 心包纤维钙化的发病机制、初步尝试针 对性的干预实验，旨在为今后 IAPCP 的临床防治提供理论基础和实验数据。 方法：为以上目的，本研究分为以下六部分。1. IAPCP 心包的分子病理研究：收集 上海长海医院资料完整、临床病理诊断明确的 IAPCP 心包标本共 45 例，其中特发性 心包炎（ Idiopathic constrictive pericarditis, ICP ） 43 例，心脏损伤后心包炎 （Post–cardiac-injury constrictive pericarditis, PCP）2 例。所有 IAPCP 病例均有石蜡包 埋组织，其中 18 例 ICP 有新鲜标本、液氮保存。正常对照心包 12 例，均为液氮保 存的新鲜标本。采用苏木素-伊红染色（Hematoxylin and Eosin, HE）观察 IAPCP 心包 的组织学特征、维多利亚蓝-苦味酸酸性复红染色（Victoria blue-van Gieson, VG）确 定纤维化程度、Von Kossa 染色检测心包内钙盐沉积情况。采用免疫组织化学和脱氧 核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（ Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL）染色确定 IAPCP 的 心包间质细胞（Pericardial interstitial cells, PICs）表型的改变和凋亡的发生。抽提新 鲜组织标本的总 RNA，qRT-PCR 分析细胞外基质相关基因表达的改变。2. TGF-β1 在 IAPCP 心包中的表达及对 PICs 的作用：采用 western blot 和免疫组织化学方法检 测转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1, TGF-β1）在 IAPCP 心包中的表达 丰度及细胞定位。分离培养正常对照心包的 PICs，并给予 TGF-β1 因子；采用 qRT-PCR 分析 TGF-β1 处理前后 PICs 细胞外基质相关基因表达的改变；明胶酶酶谱法检测明 胶酶活性的改变；动态观察 TGF-β1 诱导融合的 PICs 形成钙化结节的过程；免疫细 胞化学染色、TUNEL 染色、Von Kossa 染色确定 PICs 表型的改变、凋亡及钙盐沉积 情况；流式细胞仪和比色法定量凋亡率和钙沉积程度。3. FGF-2、PDGF、BMP-2 在 IAPCP 心包中的表达及对 PICs 的作用：采用免疫组织化学方法检测成纤维生长因子 -2（Fibroblast growth factor-2, FGF-2）、血小板源性生长因子（Platelet-derived growth factor, PDGF）和骨形成蛋白-2（Bone morphogenetic protein-2, BMP-2）在 IAPCP 心 包中的表达；分离培养 PICs，分别给予 FGF-2、PDGF-AA、BMP-2 因子后，采用免 疫细胞化学方法分析 PICs 表型的改变。4. 自体心包瓣置换主动脉瓣：再次手术心包  瓣的病理分析：对本科室所完成的 15 例自体心包瓣置换主动脉瓣手术病人行长期随 访；收集再次手术标本，采用 HE、VG 和免疫组织化学染色观察自体心包瓣的病理 组织学改变、检测 PICs 的表型。5. PICs 的生物学特征研究：分离培养 PICs 和人骨 髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）。观察 PICs 的形态和生长特征， β-半乳糖苷酶染色检测各代细胞中的衰老细胞。流式细胞仪分析 PICs 的免疫表型， 特定培养基诱导 PICs 向骨母、软骨母细胞及脂肪细胞分化，通过免疫组织化学、免 疫细胞化学及油红 O 染色分析 PICs 的分化能力。MTT 法测定 PICs 和 MSCs 的