食管鳞癌中pi3kakt、mapk和shh信号通路间交叉调控的实验分析-experimental analysis of cross regulation between pi 3 kakt, mapk and shh signaling pathways in esophageal squamous cell carcinoma.docx

食管鳞癌中 PI3K/AKT、MAPK 和 Shh 信号通路间交叉调控的实验研究 第二军医大学博士学位论文 -  PAGE 101 - -  PAGE 100 - 摘 要 食管癌是常见的原发性消化道恶性肿瘤，其在世界范围内的发病率和死亡率分别 位于恶性肿瘤的第8位和第6位。我国是食管癌高发区，而且90%以上是食管鳞状细胞 癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)。由于大部分食管癌直到疾病的晚期症 状都不明显，ESCC病人往往诊断晚、预后差、死亡率高。ESCC是一种严重危害人民 群众身体健康的疾病。在ESCC的发生、发展中有多个信号通路参与其中，这些信号 通路之间的相互交叉调控最终使肿瘤细胞获得无限增殖的生长优势，从而促进肿瘤的 发生和发展。 近年来研究表明，Sonic Hedgehog(Shh)信号转导通路与食管、胃、胰腺等消化道 肿瘤的发生密切相关。Shh通路在食管癌中呈高度激活状态，可当作一项有价值的生 物标记用于食管癌???诊断和分子分类。此外，多个研究表明Ras信号通路在恶性肿瘤 的发病过程中起着重要作用，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositol-3-OH-kinase, PI3K) / AKT信号通路和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号 通路是Ras下游的两个主要通路，上述两个信号通路主导的促有丝分裂和抗凋亡信号 在人恶性肿瘤细胞的生长和预后中扮演重要角色。目前国内外仅有小宗ESCC关于 Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路独自的研究，尚无Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通 路交叉调控与ESCC病理类型、增殖活性、生物学行为等方面的研究报道。 为探讨Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路在ESCC发生和发展过程中的作用，本 课题通过检测人ESCC中Shh、Gli1、p-AKT和p-ERK的表达，以及这些基因的表达与 ESCC临床病理特征、食管癌患者的预后等相互关系进行了研究，并利用ESCC细胞系 TE-1和TE-10进行体外实验研究，采用特异性拮抗剂对Shh通路、PI3K/AKT通路和 MAPK通路进行靶向抑制，然后检测各个通路关键因子的表达情况。通过上述实验设 计，验证ESCC中可能存在的Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路之间串话的机制。探 讨了联合抑制Shh和PI3K/AKT信号通路作为基因治疗ESCC优选靶的之一的可行性， 初步探讨Shh和PI3K/AKT信号通路影响ESCC生物学特性的可能机制。 第一部分 人食管鳞状细胞癌组织中Shh、Gli1、p-AKT和p-ERK表 达的实验研究 目的：明确Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路中的关键因子Shh、Gli1、p-AKT 和p-ERK在人ESCC组织中的表达情况，探讨Shh、PI3K/AKT通路和MAPK通路之间 的相关性。 方法：收集30例经开胸手术切除的ESCC新鲜组织标本，分为ESCC组织组和癌旁  正常食管组织组。用western-blot方法检测两组标本中Gli1、p-AKT和p-ERK蛋白的表 达情况；此外，收集88例2004年1月至2005年12月手术切除标本存档蜡块，分为ESCC 组织组和癌旁正常食管组织组，采用免疫组化染色的方法检测两组标本中Shh、Gli1、 p-AKT和p-ERK蛋白的表达情况。 结果：1、Western-blot方法检测表明：在癌旁正常食管粘膜中未检测到Gli1和 p-AKT的表达，而在大部分ESCC中检测到Gli1和p-AKT呈阳性表达；在正常食管粘膜 中p-ERK不表达或呈弱阳性表达，而在大部分ESCC中检测到p-ERK呈阳性表达。2、 免疫组化检测表明：在正常食管粘膜中未检测到Shh、Gli1和p-AKT的表达，而在大 部分ESCC中检测到Shh、Gli1和p-AKT呈阳性表达；在正常食管粘膜中p-ERK不表达 或呈弱阳性表达，而在大部分ESCC中检测到p-ERK呈阳性表达。统计分析表明ESCC 中Hh靶基因Gli1的高表达与AKT激活相关，但跟ERK激活不相关。 结论：在大部分食管癌组织中Shh、Gli1、p-AKT和p-ERK是高表达的，但在癌旁 正常食管组织中是不表达的，提示Shh、PI3K/AKT和MAPK通路在大多数食管癌中是 激活的。Gli1的表达与p-AKT的表达呈正相关，提示Shh和PI3K/AKT信号通路之间可 能存在交叉调控，即信号通路之间的“串话”。 第二部分 Shh信号通路与PI3K/AKT、MAPK信号通路之间交叉调控 机制的体外试验 目的：明确Shh通路、PI3K/AKT通路和MAPK通路之间是否存在“串话”，以及 它们之