甜菜素类生物碱诱导k562白血病细胞分化凋亡的分析-analysis of betanin alkaloids inducing differentiation and apoptosis of k562 leukemia cells.docxVIP

摘要 摘要 重庆 重庆理工大学硕士学位论文 I I PAGE PAGE VI 甜菜苷生物碱诱导 K562 白血病细胞分化凋亡的研究 摘 要 本论文对商陆（Phytolacca Americana L）果实中甜菜素类生物碱的主要成分的提 取、分离纯化、结构确证、含量测定、诱导 K562 白血病细胞株凋亡分化体外活性进 行了研究，结果如下： 1、优化商陆果实红色素的超声提取工艺 采用正交试验设计，用超声波法提取商陆果实红色素。结果表明，超声波法最佳 提取工艺为提取时间为 30min、固液比为 1:4（g：mL）、pH 值为 3、提取 2 次。超声 波提取法具有省时、简便、效率高等优点，适合大生产应用。 2、筛选出大孔树脂分离商陆红色素的工艺 对 5 种大孔树脂提取商陆红色素进行比较，考察经 AB-8 大孔树脂分离的条件以 及分离后乙醇沉淀商陆红色素的最佳工艺条件。AB-8 大孔树脂吸附商陆红色素效果 最好，其最佳工艺条件为：吸附流速 2.0mL/min、上样 pH 值为 3、洗脱剂浓度为 15% 乙醇溶液、洗脱流速 0.7mL/min；乙醇沉淀纯化商陆红色素的最佳工艺为：洗脱液浓 缩 50 倍，浓缩液：乙醇为 1:10，沉淀 3 次。经过 AB-8 大孔树脂提纯后，乙醇沉淀 不仅能够除去大部分杂质，而且大大提高了商陆红色素的品质。 3、Sephadex LH-20 纯化商陆红色素 优选 Sephadex LH-20 纯化商陆红色的工艺条件。其最佳工艺条件为：上样体积 为 5mL、线性流速为 7.15cm/h、流动相 pH 值为 3。Sephadex LH-20 不仅能够除去大 部分杂质，而且大大提高了商陆红色素的品质。 4、商陆红色素的 pre-HPLC 制备及 HPLC 分析 从 Sephadex LH-20 样品中分离纯化甜菜素，纯化甜菜素的半制备色谱条件为:半 制备型色谱柱：Crest ODS PN：Co218050-212250（5μm,21.2mm×250mm）流动相甲 醇-水（0.5%甲酸）=18：82，流速 10 mL/min，柱温室温，SPD-M10A 二极管阵列检 测器 ，进样量 2.0mL 。 分 析 甜 菜 素 的 色 谱 条 件 为 ： 色 谱 柱 Sino Chrom ODS-Bp(5μm,4.6mm×150mm)，流动相 0-30min10%-30%甲醇-水(0.5%甲酸)梯度、 30-60min10%甲醇-水(0.5%甲酸)，流速 1.0mL/min，柱温室温，SPD-M10A 二极管阵 列检测器，进样量 10μL。 5、甜菜素类化学成分的结构确证 采用超声波提取、大孔吸附树脂、Sephadex LH-20 和制备液相色谱方法，分离得 到 1 个化合物，经有机波谱（紫外吸收光谱、电喷雾质谱、核磁共振波谱）分析鉴定 为甜菜苷。 6、甜菜素含量测定方法 筛选出了紫外可见光分光光度计法和高效液相色谱法同时测定甜菜素含量的方 法。紫外可见光分光光度计法测定甜菜素含量，其结果显示，商陆果实红色素在 0.01~0.05mg/mL 范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系，回归方程为 Y=0.00478X+ 0.00566，r =0.9995；色谱条件为：色谱柱 Sino Chrom ODS-Bp(5μm,4.6mm×150mm)， 流动相 0-30min10%-30%甲醇-水(0.5%甲酸)梯度、30-60min10%甲醇-水(0.5%甲酸)， 流速 1.0mL/min，柱温室温，SPD-M10A 二极管阵列检测器，进样量 10μL。结果显 示，线性 范围 为：甜 菜苷在 6.00 ～22.00μg 范围内线 性关 系良好 ，回归 方程为 Y=1016425.225X+1824551.050，r=0.9996。该方法简便、可靠，适于甜菜素类成分的 含量测定和质量控制。 7、甜菜苷体外诱导 K562 白血病细胞株分化凋亡活性研究 本文研究从商陆果实中分离出来的甜菜红色素甜菜苷抗人类白血病细胞株 K562 活性。结果表明，甜菜苷抑制 K562 白血病细胞的增值随浓度与时间成反比，药物作 用 24h、48h、72h 的 IC50 分别为 6.395、5.304、4.796 μM。荧光显微镜和细胞形态学 的进一步研究表明，甜菜苷作用 K562 细胞后有染色质浓缩、细胞收缩、细胞膜空化 等细胞凋亡特征的出现。DNA 碎片的凝胶电泳出现有规律的 DNA 梯形图，表明甜菜 苷作用的细胞出现了凋亡。浓度 1-10μM 作用细胞，流式细胞仪分析细胞周期的变化 发现细胞周期呈现 G0/G1 期阻滞，S 期细胞数明显减少，并呈现出剂量依赖性；细胞 表面抗原实验表明 5.30μM 的甜菜苷能诱导 K562 白血病细胞分化。 关键词：