目的基因的制备龙敏南.ppt

密度梯度离心法 （富含GC的片段浮力密度大） 单链酶解法 （富含GC的片段Tm高,高Tm保留GC双链，用核酸酶S1消除单链） 分子杂交法 BAC文库插入DNA片段的检测 基因组文库和cDNA文库的建立 2、根据基因的同源性分离 （1）、通过相关数据库搜索同源序列 （2）、保守序列区域设计引物进行扩增 （3）、进行功能鉴定 (Serial Analysis of Gene Expression, SAGE) 染色体步移（chromosome walking) 首先以已知基因或分子标记为探针从基因组文库中筛选与其有共同序列的克隆，再以该克隆为探针从文库中筛选与其有部分重叠序列而且更靠近目的基因的新克隆，同理，再以新克隆为探针依次筛选新克隆，直至所需克隆的目的基因。 Fig. 8.7 Chromosome walking 酵母双杂交体系的组成 与BD蛋白融合的表达载体，被其表达的蛋白为诱饵蛋白（bait)； 与AD蛋白融合的表达载体，表达的蛋白为靶蛋白(prey)。是酵母双杂交体系最终要获得的蛋白，是上钩的一条“鱼”； 具有一个或多个报告基因的宿主菌株。 特点与优点 ⑴ 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 ⑵ 检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 ⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。 ⑷ 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析不同发育时期的蛋白。 特点 高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。 多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。 微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。 自动化：降低成本，保证质量。 芯片的设计与制备 样品制备 （核酸分子的纯化、扩增和标记） 杂交反应和信号检测 （与传统的杂交方法类似，最常用荧光法检测） 结果分析 （芯片杂交图谱的处理分析与存储由专门的软件来完成） 2. 消减杂交（subtractive hybridization） 原理：通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建消减文库的方式来分离目的基因。有mRNA消减杂交和基因组消减杂交。前者适合分析两样本中差异表达的基因，后者适合克隆两样本特异性存在的基因。 （1）、从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。 （2）、将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。 （3）、不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。 （4）、用羟基磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。 mRNA消减杂交 结合DNA-RNA杂合双链或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。 去除普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集。 羟基磷灰石柱 （Hydroxylapatite column） A A A组织 B组织 总mRNA（A） 总mRNA（B） 含蛋白A的mRNA 不含蛋白A的mRNA 总cDNA第一链 A 杂交 内含蛋白A 的cDNA 羟磷灰石柱 过柱 吸收mRNA-cDNA 单链滤过 羟磷灰石柱 A PCR cDNA消减文库 用3 ’-端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链；用3 ’-端锚定引物和5’-端10-mer随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（ mRNA differential display RT-PCR ，DDRT-PCR），在标准的序列胶中电泳2~3小时，可显示出50~100条长度在100~5000 bp之间的DNA条带。 4. mRNA差异显示PCR（DD RT-PCR） （1）3’端的锚定引物 Oligo(dT)引物的3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。 AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3’ 5’ NM TTTTTTTT M：A、G or C N: A、G、T or C 5’ 3’ （2）12种锚定引物 AG TTTTTTTT 5’ 3’ CG TTTTTTTT 5’ 3’ GG TTTTTTTT 5’ 3’ TG TTTTTTTT 5’ 3’ AA TTTTTTTT 5’ 3’ CA TTTTTTTT 5’ 3’ GA TTTTTTTT 5’ 3’ TA TTTTTTTT 5’ 3’ AC TTTTTTTT 5’ 3’ CC TTTTTTTT 5’ 3’ GC TTTTTTTT 5’ 3’ TC TTTT