48例传染性单核细胞增多症患儿EB病毒核酸定量和异型淋巴细胞实验室临床意义.docVIP

48例传染性单核细胞增多症患儿EB病毒核酸定量和异型淋巴细胞实验室临床意义 　　【摘要】目的研究传染性单核细胞增多症（以下简称传单）患儿实验室检测中EB病毒DNA和异型淋巴细胞的辅助诊断的临床意义。方法采取实时荧光PCR技术来定量检测EB病毒DNA的含量拷贝数（10×103为阳性）和血液室异型淋巴细胞计数检测比例（4%为阳性）。结果在48例传单患者中，EB病毒DNA10×103（阳性）40例，EB病毒DNA4%（阳性）22例，异型淋巴细胞4%（阴性）26例。EB病毒DNA阳性率占833%；异型淋巴细胞阳性率占458%。说明实验室检测对传单患儿有较高的辅助诊断价值。结论EB病毒DNA定量拷贝数检测有相当高的诊断价值，为临床提供传单患者的快速诊断；异型淋巴细胞检测具有458%阳性辅助诊断价值，虽然辅助诊断价值没有核酸检测高，但是对实验室条件要求不高，更适合不具备条件开展分子生物实验室的基层医院开展辅助诊断传单患者。 　　【关键词】 　　传单患者；EB病毒DNA；异型淋巴细胞；相关性 　　作者单位：563000遵义市第一人民医院检验科 　　疱疹病毒是一较大的囊膜的双链DNA病毒，分为A群和B群两个亚群。凡在体外培养时，容易从细胞内释放营养液中的病毒为A群；病毒同细胞紧密结合，很难释放到营养液中的为B群。基因组结构由末端重复序列和内部重复序列组成，疱疹病毒基因可以整合于细胞的基因内，成为细胞DNA的一部分，形成长期潜伏感染状态，疱疹病毒潜伏感染与肿瘤发生有关，尤其与鼻咽癌密切相关，EB病毒属疱疹病毒4型，EB病毒感染可引起传染性单核细胞增多症、鼻咽癌、儿童淋巴瘤。传染性单核细胞增多症是我国常见的幼儿传染病，人群普遍易感，是由EB病毒引起的急性传染病，EB病毒是一种嗜淋巴细胞病毒，70%淋巴细胞细胞增多，而且异型淋巴细胞明显增多[1]，传单患者大部分鼻咽部含有EB病毒。 　　1资料与方法 　　11一般资料 　　所有标本均来自本院确诊的病房患者和部分门诊患者，由护理人员抽取患者静脉血2～3 ml注入EDTAK2抗凝管中送检， 用水平离心机1500r/min离心10 min编号待测。男性30人，女性18人；年龄最小6月，最大13岁，平均年龄41岁，且均为临床上最后确诊为传染性单核细胞增多症48例，其中EB病毒DNA定量拷贝数10×103（阳性）40例，异淋巴细胞4%（阳性）22例。 　　12异淋巴细胞检测仪器、试剂及方法 　　异型淋巴细胞检测EDTAK2抗凝全血用SYSMEX2100血流流水线上自动推片机进行推片，自动瑞士染液染色的血片，由经验丰富的血液工作人员两人共阅片求出的均值作为最后异型淋巴细胞计数值（4%为阳性）。 　　13EB病毒DNA定量检测仪器、试剂及方法 　　使用罗氏（LightCycler480）480PCR扩增分析仪，采用中山大学达安基因试剂盒进行定量聚合酶链反应（PCR）检测，方法为实时荧光PCR技术进行定量检测。质量控制：查看阴性，阳性及标准定值是否吻合决定此次检测情况。阴性质控品：增长曲线不呈“3”型曲线或Ct=30，阳性质控品：增长曲线呈“3”型线，且强阳性质控品定量参值在10×106～20×108范围，临界阳性质控品参考值在20×102～20×104IU/ml范围（参考值为仪器自动分析计算出的数值）。阳性定量参考品：全部阳性，且线性相关系数097≤∣r∣≤1。测定结果有效必须具备以上质控条件同时满足，否则结果无效，需重做实验。检测EB病毒DNA灵敏检测范围在102～107拷贝/ml之间。 　　14操作步骤 　　141异型淋巴细胞检测EDTAK2抗凝全血充分混匀20次后，用SYSMEX2100血液流水线上自动推片机进行推片，自动瑞氏染液染色的血片，由经验丰富的血液工作人员两人共阅血片的体尾部细胞分布均匀的部位，求出的均值作为最后异型淋巴细胞计数值（4%为阳性）。 　　142EB病毒DNA的定量测定 　　1421DNA提取（标本处理区）①取15 ml灭菌离心管编号（与标本同号）。②取50 μl DNA提取液于15 ml灭菌离心管中， 细心提取血清与血细胞交界处的白细胞层，尽量吸完放入灭菌离心管中，充分吹打混匀约静置5 min。③振荡器剧烈振荡混匀5～10 s，置（100±1）℃恒温金属浴中孵育（10±1） min，12000r/min离心5 min备用。 　　1422试剂准备（试剂准备区）①从冰箱中取出EB病毒DNA检测试剂，室温解冻，取02 ml样品扩增八连管，按比例加入EB病毒DNAPCR反应液40 μl+Taq酶3 μl/人份至八连管中。②将加好试剂的扩增八连管放入试剂准备区和标本处理区之间的传递窗中。③加样：在标本处理区从传递窗中取出加好试剂的八连管于生物安全柜中加样，分