PICK1在心肌梗死大鼠血清心肌组织中表达及意义.docVIP

PICK1在心肌梗死大鼠血清心肌组织中表达及意义 　　摘要：目的 研究急性心肌梗死大鼠血清及心肌组织中蛋白激酶Cα相互作用蛋白（PICK1）的表达及意义。方法 将43只清洁级Wistar大鼠随机分为3组：正常对照组8只，心肌梗死模型组20只，假手术组15只，心肌梗死模型组采用左冠状动脉前降支结扎法构建模型，假手术组仅在左冠状动脉主干下打一松节，正常对照组不做任何干预。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）及免疫印迹法（Western-blot）分别检测1 d，3 d，7 d各组大鼠血清和心肌组织中PICK1的表达水平。结果 与正常对照组及假手术组相比，心肌梗死模型组大鼠建模后1 d血清PICK1水平略有增高，但差异无统计学意义（P0.05）；自3 d开始，模型组大鼠血清PICK1水平明显高于假手术组及正常对照组（P0.05）。与正常对照组及假手术组相比，心肌梗死模型组大鼠1 d，3 d，7 d时心肌组织PICK1蛋白的水平显著增高，差异有统计学意义（P0.05）；假手术组与正常对照组PICK1蛋白水平无统计学意义（P0.05）。结论 PICK1在心肌梗死大鼠血清及心肌组织中表达增高，可能在心肌缺血再灌注损伤中发挥一定的作用。 　　关键词：心肌梗死；蛋白激酶Cα相互作用蛋白；免疫印迹；酶联免疫吸附试验 　　中图分类号：R542.2 R256.2 文献标识码：A 　　doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2014.04.043 　　文章编号：1672-1349（2014）04-0466-02 　　冠状动脉阻塞相互作用蛋白引起的心肌缺血是缺血性心脏病中重要的致死原因，严重危害人类的健康，深入研究缺血性心脏病的分子机制，探索新的发病机制和治疗标靶，对缺血性心脏病的临床治疗具有重要的理论和现实意义。蛋白激酶C相互作用蛋白（PICK1）广泛表达于人和动物的各种组织，以大脑和睾丸中表达最高，肺中最低[1]。PICK1可与多种蛋白相互作用从而发挥多项生物学功能，现有的研究表明，PICK1与疼痛、脑卒中、精神分裂症及肿瘤等疾病相关[2-5]，其关键性作用使其成为上述疾病治疗的潜在靶点，而PICK1在心肌梗死方面的研究鲜见报道，本研究旨在观察PICK1在心肌梗死动物血清及心肌组织中的表达情况，探讨其在心肌梗死发生中的可能作用，为心肌梗死的研究提供新的思路和实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 研究材料 清洁级雄性Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供，体质量200 g～230 g。饲养条件：温度23 ℃，湿度95%，12 h明暗交替，大鼠专用饲料喂养。实验过程严格遵守伦理学准则。 　　1.2 心肌梗死动物模型制备 将43只Wistar大鼠随机分为3组：急性心肌梗死模型组20只，假手术组15只，正常对照组8只。心肌梗死模型组参照文献[6]的方法进行构建，采用1%戊巴比妥钠（剂量40 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，取仰位固定于手术台上，常规备皮消毒后，自胸骨左缘3～4肋间作一2 cm切口，钝性分离皮下组织及肌肉，打开心包，暴露心脏，以肺动脉圆锥和左心耳连线中点与心尖的连线为标志寻找左冠状动脉前降支，0号线结扎，结扎部位以下心肌颜色变暗，搏动减弱，心电显示ST段弓背抬高表明造模成功，将心脏还入胸腔，逐层缝合；假手术组仅于左冠状动脉前降支穿线，不做结扎，其余手术过程同模型组。 　　1.3 ELISA检测大鼠外周血PICK1的表达水平 分别于手术后1 d、3 d、7 d采集各组大鼠尾静脉血1 mL，室温自然凝固10 min，离心（10 min，3 000 r/min）取上清液，-70 ℃冰箱保存。ELISA检测步骤按照试剂说明书进行。 　　1.4 免疫印迹检测心肌组织PICK1的表达水平 分别于手术后1 d、3 d、7 d分批采用颈椎脱臼猝死大鼠，常规皮肤消毒，打开胸腔。称取心肌组织各0.1 g，眼科剪剪碎，加入组织裂解液，低温离心去上清（4 ℃，12 000 r/min，8 min），紫外分光光度计上测OD值，绘制标准曲线，计算蛋白含量。制备SDS-聚丙烯酰胺分离胶（8%）和浓缩胶（5%），分子量Marker及蛋白样本各上样20 μL，电泳槽中加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，60 V预电泳40 min，100 V电泳50 min。湿转膜法将蛋白转至硝酸纤维素膜（NC）上，转膜条件：电压110 V，电流350 mA，时间30 min。蛋白干粉（上海生工）室温封闭1 h，按照说明书参考浓度稀释一抗（PICK1 1∶1 000； GAPDH 1∶500），将NC膜置于其中，4 ℃冰箱过夜反应，TBST（含吐温20）缓冲液洗膜3次后置于二抗（1∶3 000）中室温轻摇反应30 min，TBST洗膜3次