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Vero细胞致肿瘤原性研究 　　【摘要】 目的：通过对生产疫苗所用的细胞系进行的致肿瘤原性实验，确定160代以内的Vero细胞可安全用于生产。方法：用Vero细胞和Hela细胞接种裸鼠，观察肿瘤的发生情况。结果：Vero细胞实验组裸鼠注射部位、肺部组织、肝脏组织均未见肿瘤组织发生；Hela细胞对照组的10只裸鼠全部有肿块形成，致癌致瘤率为10/10（100%）。结论：Vero细胞系非致瘤性细胞系，符合我国对疫苗生产所用细胞的要求，其在160代以内可安全用于疫苗生产。 　　【关键词】 Vero细胞； Hela细胞； 肿瘤原性； 研究 　　中图分类号 R73 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2016）28-0157-02 　　作为生物制品研究与生产的重要原材料，传代细胞系的株系特征，特别是其致肿瘤性，不仅直接影响到疫苗的质量，而且关系到人畜的健康与安全，因此一直被生物制品研究与生产部门所重视。生产疫苗所用细胞系应无外源因子污染，符合细胞遗传学要求，尤其应在生产所使用的细胞代次内无致肿瘤性，这才能符合我国对疫苗生产所用细胞的要求。笔者在建立传代Vero细胞种子库与工作库基础上，对研制生产疫苗所用的Vero细胞系160代进行了致肿瘤原性实验，以确定160代以内的Vero细胞可安全用于生产。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　细胞株：非洲绿猴肾Vero细胞，160代（沈阳安迪生物高科技公司）；人宫颈癌Hela细胞S-3株，13代（中国药品生物制品检定所细胞室）；（2）裸鼠：Balb/C无胸腺雌性裸鼠20只，约4周龄（中国药品生物制品检定所动物中心）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞制备 Vero细胞160代，250 ml细胞瓶，Hela细胞 　　13代4瓶，用胰酶消化，用无牛血清的Eagles MEM吹下、50 ml离心管1000 r/min，离心10 min，弃上清，加35 ml PBS重悬细胞沉淀，1000 r/min，离心10 min，弃上清，细胞沉淀用灭菌PBS洗1次，用1.5 ml PBS再洗1次，用1.5 ml PBS重悬细胞，取 　　0.1 ml，100倍稀释，细胞计数，再将细胞浓度调到1.0×108/ml，Hela细胞为1.5 ml，Vero细胞为1.5 ml。 　　1.2.2 实验方法 分为对照组和实验组，对照组每只裸鼠颈部皮下注射0.1 ml Hela细胞，实验组每只裸鼠颈下皮下注射0.1 ml Vero细胞，细胞浓度均为1.0×108/ml，各注射10只；每周观察记录1次裸鼠状态、体重及注射部位变化，观察30 d，而后将裸鼠处死，解剖，用10%中性缓冲福尔马林固定裸鼠肺、肝、颈部接种部位组织，石蜡包埋切片，常规苏木精-伊红染色，显微镜下观察[1-2]。 　　2 结果 　　2.1 一般状态 　　2.1.1 实验进行7 d时 实验组裸鼠中有3只注射部位变红，对照组裸鼠注射部位均出现直径0.4～0.6 cm的结节。 　　2.1.2 实验进行14 d时 实验组裸鼠均正常并有体重增加，对照组裸鼠注射部位均出现直径1.0～1.5 cm的结节，有2只结节中央有0.3～0.5 cm的溃疡发生。 　　2.1.3 实验进行21 d时 实验组裸鼠均正常并有体重增加，对照组裸鼠注射部位均出现直径1.0～2.0 cm的结节，其中2只裸鼠结节中央有0.5～0.8 cm的溃疡发生，2只裸鼠死亡。 　　2.1.4 实验进行30 d时 实验组裸鼠均正常并有体重增加，对照组裸鼠注射部位均出现1.0～2.0 cm的结节，有2只结节中央有0.5～1.0 cm的溃疡发生。 　　2.2 病理变化 　　通过显微镜病理切片检查，实验组（注射Vero细胞）的10只裸鼠注射部位未见异常、状态良好、体重有增加，皮下组织、肺部组织、肝脏组织的病理切片均未见肿瘤组织发生；对照组（注射Hela细胞）剩余的8只裸鼠注射部位均见肿瘤发生，肺部组织、肝脏组织均未见肿瘤组织发生（见图1、图2、图3、图4、图5、图6）。 　　图1 对照组颈部肿物的病理切片 图2 实验组接种部位皮下组织病理 　　切片 　　注：图1，Hela细胞接种裸鼠1个月颈部肿物的病理切片，未见肿瘤组织。图2，Vero细胞接种裸鼠1个月接种部位皮下组织病理切片，未见肿瘤组织 　　图3 对照组肝脏组织病理切片 图4 实验组肝脏组织病理切片 　　注：图3，Hela细胞接种裸鼠1个月肝脏组织病理切片，未见肿瘤组织。图4，Vero细胞接种裸鼠1个月肝脏组织病理切片，未见肿瘤组织 　　图5 对照组肺部组织病理切片 图6 实验组肺部组织病理切片 　　注：图5，Hela细胞接种裸鼠1个月肺部组织病理切片，未见肿瘤组织。图6，Vero细胞接种裸鼠