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GSNO对人肺腺癌A549细胞作用 　　[摘要] 目的 观察S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）对人肺腺癌A549细胞的作用，为GSNO作为药物来治疗肺癌提供依据。 方法 培养的A549细胞分别给予0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L GSNO 5个剂量，并分别培养24、48、72 h，应用CCK8试剂检测IC50；应用CCK8试剂检测二硫苏糖醇（DTT）逆转GSNO作用的给药时间点；应用原位凋亡荧光检测试剂盒检测GSNO给药组和GSNO联合DTT给药组中A549细胞的凋亡情况。 结果 GSNO分别处理24、48、72 h后检测，结果IC50分别为18.174、2.020、1.836 mmol/L；在GSNO给予20、40 min后给予DTT，结果OD值显著提高（P0.05），因而确定DTT给药时间点为GSNO给药后20 min；GSNO给药组显示凋亡细胞大量增加，GSNO联合DTT给药组则逆转了A549细胞的大量凋亡。 结论 A549细胞凋亡可能是GSNO抑制细胞生长的一个重要机制，GSNO诱导的A549细胞凋亡可能与巯基-亚硝基化修饰作用有关。GSNO能促使A549细胞凋亡，该过程对于人肺腺癌的治疗具有明显的指导意义。 　　[关键词] S-亚硝基谷胱甘肽；二硫苏糖醇；A549；肺癌 　　[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）06（b）-0008-04 　　肺癌是最常见的恶性肿瘤，在全世界显示有极强的患病率和致死率。A549细胞是来源于肺泡上皮细胞的恶性细胞系，它是体外研究人肺腺癌的标准细胞[1]。S-亚硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）是机体存在的一种内源性一氧化氮（nitric oxide，NO）供体。GSNO在体内可被迅速分解释放出NO，GSNO释放出NO后生成的副产物没有毒性。GSNO在体外是一种NO缓释剂，其特点是在细胞培养液中可持续、稳定地释放NO[2-3]。大量研究报道，NO具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用[4-6]。二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）是一种小分子的有机还原剂，DTT的用途除了作为还原剂和去保护剂，也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键[7]。目前在已证实有治疗作用的内源性S-亚硝基硫酸类化合物中，GSNO因在溶液中相对稳定而最具应用前景。DTT在本研究中主要用作GSNO的拮抗剂。 　　1材料与方法 　　1.1 主要仪器与试剂 　　人肺腺癌A549细胞（中科院上海细胞所）；RPMI 1640培养基（Gibco公司，美国）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；CCK8（Dojindo实验室，日本）；细胞原位凋亡荧光检测试剂盒（Roche公司，美国）；BioTek酶标仪（Sigma公司，美国）；Zeiss倒置显微镜（德国）；Olympus倒置荧光显微镜（日本）；96孔板（Corning公司，美国）。 　　1.2 细胞培养方法 　　将人肺腺癌A549细胞放于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养，按常规方法进行传代培养。细胞呈单层贴壁生长。实验均取对数生长期的细胞。 　　1.3实验分组及处理 　　分别检测生理盐水对照组、GSNO给药组（根据GSNO IC50测定结果给予2 mmol/L）、GSNO联合DTT给药组（给予GSNO后，分别在20、40、60、80、100 min后给予10 mmol/L DTT处理）。 　　1.4 GSNO对细胞抑制率的计算 　　A549细胞以每孔含1×104个细胞，体积为100 μl的密度种植于96孔板。贴壁过夜，给予GSNO处理（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L），分别培养24、48、72 h后，每孔加入CCK8 100 μl，培养箱中孵育1 h后在酶标仪上检测吸光度值（波长为490 nm）。其中细胞抑制率（inhibitory ratios，IR）=（GSNO给药组平均吸光度值-GSNO联合DTT给药组平均吸光度值）/ GSNO给药组平均吸光度值×100%。 　　1.5 细胞凋亡检测 　　A549细胞（1×105个细胞/孔）种植于12孔板（Corning公司，美国），分别给予同体积生理盐水、2 mmol/L GSNO和2 mmol/L GSNO+10 mmol/L DTT（GSNO处理40 min之后加）。培养48 h后，用4%的冰多聚甲醛-PBS溶液固定15 min，PBS清洗3次，加2 μg/ml DAPI在37℃下避光染20 min，接下来的凋亡检测则根据细胞原位凋亡荧光检测试剂盒中的步骤进行。