COX2基因沉默对人胃癌细胞系SGC7901裸鼠成瘤影响.docVIP

COX2基因沉默对人胃癌细胞系SGC7901裸鼠成瘤影响 　　[摘要]目的 研究COX-2基因沉默对人胃癌细胞系SGC-7901裸鼠成瘤的影响。方法构建靶向COX-2的短发夹状双链RNA(shRNA)的真核表达质粒转染人胃癌细胞系SGC-7901，采用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。15只裸鼠随机分为3组，每组5只，皮下接种胃癌细胞。抑制组：接种转染抑制质粒的胃癌细胞；正常对照组：接种未转染的胃癌细胞；阴性对照组：接种转染阴性对照质粒的胃癌细胞。接种4周后比较各组裸鼠皮下形成瘤体的大体和病理情况并计算抑瘤率。结果转染靶向COX-2的shRNA抑制质粒后细胞中COX-2的表达被明显抑制，抑制率为70.42％。正常对照组和阴性对照组所有裸鼠均有瘤体形成，平均瘤质量分别为(0.49±0.017)g和(0.49±0.013)g。抑制组仅2只有瘤体形成，平均瘤质量(0.05*0.003)g，与正常对照组相比差别有统计学意义(P0.0I)，抑瘤率为89.8％。结论运用RNA干扰可以高效特异地抑制人胃癌细胞系SGC-7901中COX-2的表达.COX-2被抑制后SGC-7901的生长和活性也被明显抑制。 　　[关键词]RNA干扰；COX-2；胃癌；细胞系；裸鼠 　　[中图分类号]R-33，R735.2　[文献标识码]A [文章编号]1671―7562(2007)05―0351―05 　　 　　研究表明环氧化酶-2(COX-2)在多种肿瘤发生的早期即呈高表达状态，且与肿瘤的发生发展关系密切。通过抑制COX-2蛋白的表达来预防和治疗相关的肿瘤是近年来研究的热点。RNA干扰(RNAi)是指转录后由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的同源序列mRNA的特异性降解，从而导致相应基因表达减少(knock down)或沉默(gene silencing)。本实验中我们希望利用RNAi技术，通过构建表达靶向COX-2的短发夹状双链RNA(shRNA)的表达质粒，转染人胃癌细胞系SGC-7901，抑制细胞中COX-2的表达，研究COX-2基因沉默对人胃癌细胞系SGC-7901裸鼠成瘤的影响。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1．1　材料和试剂 　　无特殊致病原(SPF)级裸小鼠BALB／CAnu品系15只，4周龄，均为雌性(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)。靶向COX-2的shRNA干扰质粒WBH1由武汉晶赛生物工程技术公司协助设计构建，其靶向干扰序列为5′-AAGTGCGATTGTACCCGGACA-3′。DNA引物的前向序列为5′-GATCCGTGCGATTGTACCCGGACATTCAAGACGTGTCCGGGTACAATCGCACTFTTTTGAATTCA-3′，反向序列为3′-GCACGCTAACATGGGCCTGTAAGTTCTGCACAGGCCCATGTTAGCGTGAAAAAACTTAAGTTCGA-5′。同时设计一条经BLAST与现有基因文库中所有人源基因均无同源性的非特异性序列5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3′，构建阴性对照质粒，称为HK。中分化人胃腺癌细胞系SGC-7901为本实验室自备。RPMI 1640培养基购自武汉亚法生物公司。小牛血清购自北京中山生物技术有限公司。转染试剂阳离子脂质体METAFECTENE购自Biontex公司，细胞裂解液和底物化学荧光自显影试剂盒购自PIERCE公司，COX-2、actin羊抗人多克隆一抗和辣根酶标记兔抗山羊IgG购自Santa Cruz公司。 　　 　　1．2　方法 　　1．2．1　细胞培养。胃腺癌细胞系SGC-7901，以含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、体积分数为5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。待细胞汇片基本铺满瓶底时传代。 　　1．2．2　细胞转染。将人胃癌细胞系SGC-7901接种于六孔板中，每孔加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基2ml。置二氧化碳培养箱中培养(37℃，5％CO2)，隔日更换培养液。待细胞汇片至80％时，用无血清RPMI 1640培养基洗3遍。将质粒和阳离子脂质体按照每1μg质粒加入5μl脂质体的比例混合于无血清RPMI 1640培养基中，室温静置15min，然后均匀滴加入六孔板，每孔200μl。3h后更换为含血清培养基，48h后荧光显微镜下观察转染情况。 　　1．2．3　抑制效果检测。采用RT-PCR和Western blot两种方法分别检测细胞中COX-2 mRNA和蛋白质含量。实验分3组，分别为转染质粒WBHI的细胞组、转染阴性对照质粒HK的细胞组和未转染细胞组。用常规RT-PCR法